【摘要】：第一部分載UCNPs-RB相變型納米粒的制備、表征、性能目的制備以全氟己烷(PFH)為內(nèi)核、葉酸修飾的脂質(zhì)為殼,包載了上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米粒偶聯(lián)光敏劑孟加拉玫瑰紅(UCNPs-RB)、化療藥10-羥基喜樹堿(HCPT)的納米粒FA/UCNPs-RB/HCPT/PFH@Lipid(縮寫為FURH-PFH-NPs),使其具有聲致相變、多模態(tài)成像、腫瘤治療的性能。方法(1)制備光敏劑孟加拉玫瑰紅和稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米粒的共價偶聯(lián)產(chǎn)物,并驗證其具備發(fā)生熒光共振能量傳遞的功能(FRET)。(2)采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的方法制備脂質(zhì)膜。(3)利用超聲法制備這種多功能FURH-PFH-NPs。(4)利用光鏡、電鏡、Malvern激光粒徑分析儀等儀器對其進行基本性能的檢測及驗證,為后續(xù)實驗提供相應(yīng)的支持。結(jié)果通過透射電鏡觀察FURH-PFH-NPs,發(fā)現(xiàn)其大小、形態(tài)較均勻,呈球形,UCNPs-RB均勻分布并且突出其表面,分散性好。Malvern激光粒徑儀所檢測的粒徑為220.2±76nm,分散指數(shù)(PDI)為0.093,Zeta電位為-0.24mV。能譜儀EDS檢測其能譜圖中包含有Na和La元素的峰。在4℃條件下,FURH-PFH-NPs的粒徑在72h內(nèi)無明顯增大,而72h后粒徑才緩慢增大。用2.0W/cm~2超聲功率LIFU作用后,2min時FURH-PFH-NP觀察到相變,隨時間延長出現(xiàn)了大量相變的微泡。新型FURH-PFH-NPs的單線態(tài)氧產(chǎn)量檢測結(jié)果:在激光輻照6min后消耗DPBF十分明顯,在10min消耗DPBF約85%,通過間接檢測新型FURH-PFH-NPs具有高效單線態(tài)氧產(chǎn)生量。結(jié)論成功制備了造影劑FURH-PFH-NPs,形態(tài)呈球形,其上鑲嵌有UCNPs-RB顆粒,大小均一,穩(wěn)定性好,具有較好的聲致相變和產(chǎn)生單線態(tài)氧的能力。第二部分載UCNPs-RB相變型納米粒體外實驗研究目的觀察FURH-PFH-NPs的細胞毒性并篩選適宜給藥濃度、超聲作用參數(shù)及激光輻照與FURH-PFH-NPs結(jié)合作用后對卵巢癌細胞SKOV3的影響,然后研究這種造影劑在體外靶向性和光動力治療性能,最后研究其體外增強超聲、光聲和熒光成像的能力。方法(1)通過MTT法對FURH-PFH-NPs細胞毒性的檢測來篩選出給藥濃度,接著進行超聲作用及激光參數(shù)的篩選,并通過流式細胞儀及熒光顯微鏡觀察初步評價其靶向性及光動力治療的效果。(2)進行FURH-PFH-NPs體外超聲成像研究,觀察FURH-PFH-NPs在不同功率的超聲作用下經(jīng)過不同的作用時間所得到的超聲成像效果,進行統(tǒng)計分析。(3)探索其光聲成像性能,并分析成像原理及定量分析。最后研究了FURH-PFH-NPs熒光成像的能力,并觀察超聲作用前后其熒光成像的能力。結(jié)果(1)根據(jù)細胞活性實驗結(jié)果(MTT法)選擇FURH-PFH-NPs濃度為100μL/ml,超聲參數(shù)是2W/cm2,2min,激光參數(shù)是0.2W/cm2120s,完成后續(xù)的細胞實驗。(2)不同因素對細胞活性的影響,加入FURH-PFH-NPs后各組細胞的活力均受到一定的影響,對細胞抑制率較不加FURH-PFH-NPs組明顯升高,提示FURH-PFH-NPs抑制了細胞的增殖。流式細胞檢測的結(jié)果是凋亡以早期(右下)和晚期(右上)細胞凋亡率為其表現(xiàn)。在免疫熒光下看到經(jīng)FURH-PFH-NPs處理后的細胞內(nèi)細胞核體積增大,部分破碎,細胞核內(nèi)的染色質(zhì)濃縮、分布不均勻,且邊緣化,這說明細胞處于凋亡的不同時期。提示FURH-PFH-NPs加上超聲和激光后具有明顯促進腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞生長的作用。(3)體外光動力作用的評價結(jié)果是通過用DCFH-DA孵育后的熒光強度來判斷其單線態(tài)氧的產(chǎn)生能力。分為:FURH-PFH-NPs+US+Laser、FURH-PFH-NPs+US、FURH-PFH-NPs+Laser組。使細胞內(nèi)產(chǎn)生ROS最強的是FURH-PFH-NPs+US+Laser組。FURH-PFH-NPs體外的靶向性激光共聚焦結(jié)果顯示葉酸具備高效連接其受體的能力,通過圖片展示了葉酸與細胞的特異性結(jié)合。(4)體外成像結(jié)果顯示:灰階超聲回聲強度以2.0W/cm2最強,并且與其他功率相比具有顯著性差異,2.0W/cm2的超聲回聲強度在不同作用時間1min、2min、4min無顯著性差異;作用2min的灰階超聲和造影模式均表現(xiàn)為平均聲強最大。FURH-PFH-NPs通過活體熒光成像系統(tǒng)激發(fā)波長為980nm,發(fā)射波長為650nm進行熒光成像,用RB濃度計算,從0.125mg/ml-2mg/ml均可以出現(xiàn)熒光成像,并且有非常明顯的濃度正相關(guān)性。FURH-PFH-NPs具有的光聲成像性能,在705nm有一個特異吸收峰,PA值在3.4a.u,發(fā)現(xiàn)光聲強度與濃度之間呈線性正相關(guān)。結(jié)論FURH-PFH-NPs具有腫瘤細胞靶向性,可產(chǎn)生良好的光動力治療效果,有良好的增強體內(nèi)外超聲、光聲和熒光對多模態(tài)成像的性能。第三部分載UCNPs-RB相變型納米粒體內(nèi)實驗研究目的研究FURH-PFH-NPs納米粒在體內(nèi)的超聲/光聲/熒光三種成像性能;以體內(nèi)超聲/光聲/熒光三種成像做指導研究納米粒在超聲作用下腫瘤靶向性,篩選適宜治療時間窗;注射FURH-PFH-NPs后超聲作用后用激光照射腫瘤治療SKOV3卵巢癌裸鼠移植瘤,觀察這種方法的光動力和化療治療效果并評價。方法(1)應(yīng)用SKOV3卵巢癌細胞系對裸鼠進行皮下移植成瘤。(2)首先體內(nèi)熒光成像初步篩選治療時間窗,然后利用荷瘤裸鼠的超聲成像特點進一步驗證治療時間窗:注射靶向組與非靶向組納米粒后連續(xù)進行觀察,觀察時間點為:即刻、0.5h、1h、6h、12h、24h、48h。研究其超聲成像性能及定量分析,最后再研究納米粒體內(nèi)光聲成像性能。(3)為了研究體內(nèi)三模態(tài)成像能否指導納米粒體內(nèi)腫瘤靶向性,進行了瘤體內(nèi)納米粒分布的病理實驗:將30只荷瘤裸鼠隨機分為靶向組與非靶向組,分別經(jīng)鼠尾靜脈注射FURH-PFH-NPs和URH-PFH-NPs,并于注射后的0.5h、1h、6h、12h、24h脫頸處死裸鼠,迅速將瘤體取出制成40um病理切片,用顯微鏡觀察瘤體病理切片內(nèi)納米粒分布的狀態(tài)。(4)靶向治療實驗:將20只荷瘤裸鼠隨機分為4組:FURH-PFH-NPs+US+Laser組、FURH-PFH-NPs+Laser組、HCPT組、生理鹽水組。14天隔日進行相應(yīng)處理并測量腫瘤的大小,計算腫瘤生長曲線和抑瘤率;14天后處死裸鼠、取出瘤體行免疫組織化學方法檢測腫瘤組織細胞中增殖指標PCNA和缺氧指標HIF-1α表達情況。結(jié)果(1)熒光成像顯示,注射FURH-PFH-NPs后,荷瘤裸鼠腫瘤內(nèi)高峰期在6h時開始出現(xiàn),12h逐漸下降;(2)注射FURH-PFH-NPs后,低強度聚焦超聲作用前腫瘤內(nèi)灰階及超聲造影模式均呈無回聲,超聲作用后兩種成像模式均出現(xiàn)回聲增強,利用回聲強度定量分析發(fā)現(xiàn)回聲增強在6h達峰,并持續(xù)約6h;(3)納米粒在瘤體內(nèi)分布實驗:在不同時間點,靶向組腫瘤病理切片均有FURH-PFH-NPs分布,1h出現(xiàn),在6h瘤體內(nèi)FURH-PFH-NPs分布最多;而非靶向組僅有極少量FURH-PFH-NPs分布。(4)靶向治療實驗:FURH-PFH-NPs組裸鼠腫瘤生長指數(shù)最低、抑瘤率最高。(5)免疫組化結(jié)果:與對照組相比,FURH-PFH-NPs組的增殖指標PCNA、缺氧指標HIF-1α表達均減低。結(jié)論(1)FURH-PFH-NPs具有良好的超聲/熒光/光聲成像能力;(2)在超聲作用下,6h高峰聚集于裸鼠卵巢癌移植瘤內(nèi)。(3)在激光的輻照下發(fā)揮光動力治療與化療的協(xié)調(diào)作用,期望這種協(xié)同治療方式可以成為治療惡性腫瘤新途徑。
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R737.31

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本文編號：2765936