【摘要】：第一部分載UCNPs-RB相變型納米粒的制備、表征、性能目的制備以全氟己烷(PFH)為內(nèi)核、葉酸修飾的脂質(zhì)為殼,包載了上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米粒偶聯(lián)光敏劑孟加拉玫瑰紅(UCNPs-RB)、化療藥10-羥基喜樹(shù)堿(HCPT)的納米粒FA/UCNPs-RB/HCPT/PFH@Lipid(縮寫(xiě)為FURH-PFH-NPs),使其具有聲致相變、多模態(tài)成像、腫瘤治療的性能。方法(1)制備光敏劑孟加拉玫瑰紅和稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米粒的共價(jià)偶聯(lián)產(chǎn)物,并驗(yàn)證其具備發(fā)生熒光共振能量傳遞的功能(FRET)。(2)采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的方法制備脂質(zhì)膜。(3)利用超聲法制備這種多功能FURH-PFH-NPs。(4)利用光鏡、電鏡、Malvern激光粒徑分析儀等儀器對(duì)其進(jìn)行基本性能的檢測(cè)及驗(yàn)證,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供相應(yīng)的支持。結(jié)果通過(guò)透射電鏡觀察FURH-PFH-NPs,發(fā)現(xiàn)其大小、形態(tài)較均勻,呈球形,UCNPs-RB均勻分布并且突出其表面,分散性好。Malvern激光粒徑儀所檢測(cè)的粒徑為220.2±76nm,分散指數(shù)(PDI)為0.093,Zeta電位為-0.24mV。能譜儀EDS檢測(cè)其能譜圖中包含有Na和La元素的峰。在4℃條件下,FURH-PFH-NPs的粒徑在72h內(nèi)無(wú)明顯增大,而72h后粒徑才緩慢增大。用2.0W/cm~2超聲功率LIFU作用后,2min時(shí)FURH-PFH-NP觀察到相變,隨時(shí)間延長(zhǎng)出現(xiàn)了大量相變的微泡。新型FURH-PFH-NPs的單線態(tài)氧產(chǎn)量檢測(cè)結(jié)果:在激光輻照6min后消耗DPBF十分明顯,在10min消耗DPBF約85%,通過(guò)間接檢測(cè)新型FURH-PFH-NPs具有高效單線態(tài)氧產(chǎn)生量。結(jié)論成功制備了造影劑FURH-PFH-NPs,形態(tài)呈球形,其上鑲嵌有UCNPs-RB顆粒,大小均一,穩(wěn)定性好,具有較好的聲致相變和產(chǎn)生單線態(tài)氧的能力。第二部分載UCNPs-RB相變型納米粒體外實(shí)驗(yàn)研究目的觀察FURH-PFH-NPs的細(xì)胞毒性并篩選適宜給藥濃度、超聲作用參數(shù)及激光輻照與FURH-PFH-NPs結(jié)合作用后對(duì)卵巢癌細(xì)胞SKOV3的影響,然后研究這種造影劑在體外靶向性和光動(dòng)力治療性能,最后研究其體外增強(qiáng)超聲、光聲和熒光成像的能力。方法(1)通過(guò)MTT法對(duì)FURH-PFH-NPs細(xì)胞毒性的檢測(cè)來(lái)篩選出給藥濃度,接著進(jìn)行超聲作用及激光參數(shù)的篩選,并通過(guò)流式細(xì)胞儀及熒光顯微鏡觀察初步評(píng)價(jià)其靶向性及光動(dòng)力治療的效果。(2)進(jìn)行FURH-PFH-NPs體外超聲成像研究,觀察FURH-PFH-NPs在不同功率的超聲作用下經(jīng)過(guò)不同的作用時(shí)間所得到的超聲成像效果,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。(3)探索其光聲成像性能,并分析成像原理及定量分析。最后研究了FURH-PFH-NPs熒光成像的能力,并觀察超聲作用前后其熒光成像的能力。結(jié)果(1)根據(jù)細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(MTT法)選擇FURH-PFH-NPs濃度為100μL/ml,超聲參數(shù)是2W/cm2,2min,激光參數(shù)是0.2W/cm2120s,完成后續(xù)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。(2)不同因素對(duì)細(xì)胞活性的影響,加入FURH-PFH-NPs后各組細(xì)胞的活力均受到一定的影響,對(duì)細(xì)胞抑制率較不加FURH-PFH-NPs組明顯升高,提示FURH-PFH-NPs抑制了細(xì)胞的增殖。流式細(xì)胞檢測(cè)的結(jié)果是凋亡以早期(右下)和晚期(右上)細(xì)胞凋亡率為其表現(xiàn)。在免疫熒光下看到經(jīng)FURH-PFH-NPs處理后的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞核體積增大,部分破碎,細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)濃縮、分布不均勻,且邊緣化,這說(shuō)明細(xì)胞處于凋亡的不同時(shí)期。提示FURH-PFH-NPs加上超聲和激光后具有明顯促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。(3)體外光動(dòng)力作用的評(píng)價(jià)結(jié)果是通過(guò)用DCFH-DA孵育后的熒光強(qiáng)度來(lái)判斷其單線態(tài)氧的產(chǎn)生能力。分為:FURH-PFH-NPs+US+Laser、FURH-PFH-NPs+US、FURH-PFH-NPs+Laser組。使細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生ROS最強(qiáng)的是FURH-PFH-NPs+US+Laser組。FURH-PFH-NPs體外的靶向性激光共聚焦結(jié)果顯示葉酸具備高效連接其受體的能力,通過(guò)圖片展示了葉酸與細(xì)胞的特異性結(jié)合。(4)體外成像結(jié)果顯示:灰階超聲回聲強(qiáng)度以2.0W/cm2最強(qiáng),并且與其他功率相比具有顯著性差異,2.0W/cm2的超聲回聲強(qiáng)度在不同作用時(shí)間1min、2min、4min無(wú)顯著性差異;作用2min的灰階超聲和造影模式均表現(xiàn)為平均聲強(qiáng)最大。FURH-PFH-NPs通過(guò)活體熒光成像系統(tǒng)激發(fā)波長(zhǎng)為980nm,發(fā)射波長(zhǎng)為650nm進(jìn)行熒光成像,用RB濃度計(jì)算,從0.125mg/ml-2mg/ml均可以出現(xiàn)熒光成像,并且有非常明顯的濃度正相關(guān)性。FURH-PFH-NPs具有的光聲成像性能,在705nm有一個(gè)特異吸收峰,PA值在3.4a.u,發(fā)現(xiàn)光聲強(qiáng)度與濃度之間呈線性正相關(guān)。結(jié)論FURH-PFH-NPs具有腫瘤細(xì)胞靶向性,可產(chǎn)生良好的光動(dòng)力治療效果,有良好的增強(qiáng)體內(nèi)外超聲、光聲和熒光對(duì)多模態(tài)成像的性能。第三部分載UCNPs-RB相變型納米粒體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究目的研究FURH-PFH-NPs納米粒在體內(nèi)的超聲/光聲/熒光三種成像性能;以體內(nèi)超聲/光聲/熒光三種成像做指導(dǎo)研究納米粒在超聲作用下腫瘤靶向性,篩選適宜治療時(shí)間窗;注射FURH-PFH-NPs后超聲作用后用激光照射腫瘤治療SKOV3卵巢癌裸鼠移植瘤,觀察這種方法的光動(dòng)力和化療治療效果并評(píng)價(jià)。方法(1)應(yīng)用SKOV3卵巢癌細(xì)胞系對(duì)裸鼠進(jìn)行皮下移植成瘤。(2)首先體內(nèi)熒光成像初步篩選治療時(shí)間窗,然后利用荷瘤裸鼠的超聲成像特點(diǎn)進(jìn)一步驗(yàn)證治療時(shí)間窗:注射靶向組與非靶向組納米粒后連續(xù)進(jìn)行觀察,觀察時(shí)間點(diǎn)為:即刻、0.5h、1h、6h、12h、24h、48h。研究其超聲成像性能及定量分析,最后再研究納米粒體內(nèi)光聲成像性能。(3)為了研究體內(nèi)三模態(tài)成像能否指導(dǎo)納米粒體內(nèi)腫瘤靶向性,進(jìn)行了瘤體內(nèi)納米粒分布的病理實(shí)驗(yàn):將30只荷瘤裸鼠隨機(jī)分為靶向組與非靶向組,分別經(jīng)鼠尾靜脈注射FURH-PFH-NPs和URH-PFH-NPs,并于注射后的0.5h、1h、6h、12h、24h脫頸處死裸鼠,迅速將瘤體取出制成40um病理切片,用顯微鏡觀察瘤體病理切片內(nèi)納米粒分布的狀態(tài)。(4)靶向治療實(shí)驗(yàn):將20只荷瘤裸鼠隨機(jī)分為4組:FURH-PFH-NPs+US+Laser組、FURH-PFH-NPs+Laser組、HCPT組、生理鹽水組。14天隔日進(jìn)行相應(yīng)處理并測(cè)量腫瘤的大小,計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)曲線和抑瘤率;14天后處死裸鼠、取出瘤體行免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)腫瘤組織細(xì)胞中增殖指標(biāo)PCNA和缺氧指標(biāo)HIF-1α表達(dá)情況。結(jié)果(1)熒光成像顯示,注射FURH-PFH-NPs后,荷瘤裸鼠腫瘤內(nèi)高峰期在6h時(shí)開(kāi)始出現(xiàn),12h逐漸下降;(2)注射FURH-PFH-NPs后,低強(qiáng)度聚焦超聲作用前腫瘤內(nèi)灰階及超聲造影模式均呈無(wú)回聲,超聲作用后兩種成像模式均出現(xiàn)回聲增強(qiáng),利用回聲強(qiáng)度定量分析發(fā)現(xiàn)回聲增強(qiáng)在6h達(dá)峰,并持續(xù)約6h;(3)納米粒在瘤體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn):在不同時(shí)間點(diǎn),靶向組腫瘤病理切片均有FURH-PFH-NPs分布,1h出現(xiàn),在6h瘤體內(nèi)FURH-PFH-NPs分布最多;而非靶向組僅有極少量FURH-PFH-NPs分布。(4)靶向治療實(shí)驗(yàn):FURH-PFH-NPs組裸鼠腫瘤生長(zhǎng)指數(shù)最低、抑瘤率最高。(5)免疫組化結(jié)果:與對(duì)照組相比,FURH-PFH-NPs組的增殖指標(biāo)PCNA、缺氧指標(biāo)HIF-1α表達(dá)均減低。結(jié)論(1)FURH-PFH-NPs具有良好的超聲/熒光/光聲成像能力;(2)在超聲作用下,6h高峰聚集于裸鼠卵巢癌移植瘤內(nèi)。(3)在激光的輻照下發(fā)揮光動(dòng)力治療與化療的協(xié)調(diào)作用,期望這種協(xié)同治療方式可以成為治療惡性腫瘤新途徑。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R737.31

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本文編號(hào)：2765936