【摘要】：早產(chǎn)全球發(fā)生率平均高達(dá)百分之十,是造成新生兒死亡的首位原因,幸存者成年后也會(huì)遺留一系列并發(fā)癥。因此,研究早產(chǎn)發(fā)生的機(jī)理,控制其發(fā)生發(fā)展刻不容緩。人類分娩是一個(gè)復(fù)雜且物種特異性的過程,導(dǎo)致至今仍未能闡明分娩啟動(dòng)的調(diào)控機(jī)制,因而臨床上依然沒有能有效防治早產(chǎn)的手段。為此,我們收集臨床足月未臨產(chǎn)以及足月臨產(chǎn)各十例人子宮肌樣本進(jìn)行第二代測(cè)序。全轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),在足月臨產(chǎn)的人子宮肌里FN14、Furin以及SULF1與足月未臨產(chǎn)存在明顯差異。其中Furin蛋白作為前蛋白轉(zhuǎn)化酶,可作用于眾多底物,參與了包括癌癥、動(dòng)脈粥樣硬化以及由細(xì)菌或病毒引起的感染等諸多疾病過程。那么探究高表達(dá)的Furin在子宮激活中所發(fā)揮的作用,將有助于解釋人類正常分娩啟動(dòng)及早產(chǎn)的分子機(jī)制。因此本課題我們將圍繞Furin對(duì)子宮肌激活的調(diào)控機(jī)制展開探討。首先從臨床上收集人妊娠相關(guān)組織樣本(子宮肌、絨毛膜和羊膜),進(jìn)一步明確在人類分娩啟動(dòng)時(shí)Furin的表達(dá)水平是否發(fā)生改變。而后我們利用原代培養(yǎng)的子宮平滑肌細(xì)胞,探究Furin對(duì)子宮平滑肌細(xì)胞收縮力的影響�？紤]到人體樣本的倫理要求以及體外實(shí)驗(yàn)的局限性,我們構(gòu)建正常妊娠以及感染性/非感染誘導(dǎo)的小鼠早產(chǎn)模型,從而在整體動(dòng)物水平上探究Furin在分娩啟動(dòng)發(fā)生過程中的作用。通過以上探索,將為臨床防治早產(chǎn)尋找治療靶點(diǎn)提供新思路。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:一、人足月臨產(chǎn)子宮肌組織中Furin表達(dá)水平顯著升高1.RNA-seq檢測(cè)數(shù)據(jù)表明人足月臨產(chǎn)子宮肌中Furin、FN14和SULF1的表達(dá)較足月未臨產(chǎn)升高最為顯著。2.進(jìn)一步RT-PCR、Western blotting以及IHC檢測(cè)結(jié)果表明在人臨產(chǎn)子宮平滑肌組織中Furin mRNA及蛋白水平表達(dá)較足月未臨產(chǎn)明顯上調(diào)。3.但臨產(chǎn)前后人絨毛膜和羊膜組織中Furin表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。二、Furin調(diào)控子宮肌細(xì)胞中收縮相關(guān)蛋白的表達(dá)及細(xì)胞收縮力1.Furin siRNA敲低Furin表達(dá)后,原代培養(yǎng)的子宮平滑肌細(xì)胞中收縮相關(guān)蛋白OTR、CX43、FP、COX2以及p-P65和p-MLC20均表達(dá)下調(diào)。2.Furin抑制劑CMK處理以及轉(zhuǎn)染Furin siRNA后細(xì)胞收縮力均顯著降低。3.細(xì)胞轉(zhuǎn)染Furin OVE過表達(dá)慢病毒后細(xì)胞收縮力增強(qiáng)。綜上表明Furin可促進(jìn)人子宮肌細(xì)胞中UAPs的表達(dá)并增強(qiáng)細(xì)胞收縮力。三、妊娠末期抑制小鼠體內(nèi)Furin表達(dá)可推遲其正常分娩1.RT-PCR與Western blotting檢測(cè)結(jié)果表明在小鼠妊娠第19d以及臨產(chǎn)時(shí)子宮平滑肌組織中Furin mRNA及蛋白表達(dá)水平較妊娠第15d、17d均有明顯上調(diào)2.在ICR小鼠妊娠第17.5d/18.5d分別大腿肌肉注射Furin抑制劑CMK或D6R(1mg/kg)后,均可明顯推遲小鼠正常分娩。且D6R對(duì)分娩啟動(dòng)的推遲作用呈劑量依賴性。3.受高劑量D6R影響延遲分娩的小鼠子宮肌組織中Furin蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但收縮相關(guān)蛋白中除了OTR差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義之外,COX2、CX43以及FP均表達(dá)下調(diào)。4.受高劑量D6R影響延遲分娩的小鼠子宮肌組織可見糖原異常聚集、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、平滑肌中出現(xiàn)異�？张莺妥允膳�,以及細(xì)胞核有固縮,存在凋亡傾向,并伴有部分肌絲斷裂。由此表明Furin參與了正常妊娠的分娩啟動(dòng)。四、探尋Furin參與分娩啟動(dòng)的可能分子機(jī)制(一)兩種早產(chǎn)模型小鼠子宮肌中Furin均未被激活1.RU38486誘導(dǎo)的無菌性早產(chǎn)時(shí),小鼠子宮肌中Furin未被激活,Furin抑制劑CMK和D6R均不能推遲其早產(chǎn)。2.LPS誘導(dǎo)的炎癥性早產(chǎn)時(shí),小鼠子宮肌中Furin也未被激活,Furin抑制劑D6R也不能推遲其早產(chǎn)。(二)Furin通過活化TWEAK-FN14途徑激活NFκB通路調(diào)節(jié)UAPs的表達(dá)1.Furin抑制劑D6R處理、轉(zhuǎn)染Furin siRNA以及Furin OVE后細(xì)胞上清中人27因子含量均無明顯改變。2.Furin抑制劑D6R處理以及轉(zhuǎn)染Furin siRNA后細(xì)胞上清中TWEAK含量均減少,同時(shí)D6R處理后細(xì)胞中全長TWEAK蛋白表達(dá)增多。3.細(xì)胞轉(zhuǎn)染Furin OVE后細(xì)胞上清中TWEAK含量增多。4.小鼠妊娠末期肌注Furin抑制劑D6R(1.5mg/kg)后,血清中TWEAK含量降低,子宮肌中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。5.Furin抑制劑D6R處理細(xì)胞后,磷酸化P65表達(dá)降低,而給予TWEAK處理后,磷酸化P65表達(dá)卻升高。6.RT-PCR,Western blotting及IHC檢測(cè)結(jié)果均提示足月臨產(chǎn)時(shí)TWEAK的受體FN14在人子宮肌中表達(dá)明顯上調(diào),而絨毛膜和羊膜中表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。7.子宮肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染FN14 siRNA后,細(xì)胞中收縮相關(guān)蛋白OTR、CX43、FP及COX2均表達(dá)下調(diào)。8.在轉(zhuǎn)染FN14 siRNA以及FN14拮抗劑(L524-0366)處理后細(xì)胞收縮力均顯著降低,而給予TWEAK處理后細(xì)胞收縮力卻增強(qiáng)。9.與妊娠第17d相比,妊娠第19d以及臨產(chǎn)時(shí)小鼠子宮肌中FN14的表達(dá)都有顯著上調(diào)。同時(shí)抑制FN14可明顯推遲小鼠正常分娩。10人原代子宮平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染FN14 siRNA后,細(xì)胞中p-P65及p-MLC20均表達(dá)降低。綜上表明Furin可通過剪切活化TWEAK,觸發(fā)TWEAK-FN14途徑,進(jìn)而激活NFκB通路導(dǎo)致人子宮肌細(xì)胞中UAPs表達(dá)上調(diào)和細(xì)胞收縮力增強(qiáng),最后引起分娩啟動(dòng)的發(fā)生。結(jié)論1.前蛋白轉(zhuǎn)化酶Furin特異性在足月臨產(chǎn)的子宮肌中表達(dá)增多,其可促進(jìn)子宮平滑肌細(xì)胞中UAPs的表達(dá)。在整體動(dòng)物模型上,Furin抑制劑可顯著推遲小鼠正常分娩的發(fā)生,但不能影響無菌性以及炎癥性早產(chǎn)的發(fā)生。提示Furin可能直接影響子宮平滑肌的收縮力而啟動(dòng)了分娩的發(fā)生。2.TNFR超家族成員FN14也特異性在足月臨產(chǎn)子宮肌中表達(dá)上調(diào)。同時(shí)Furin可切割其配體TWEAK并促其活化,TWEAK-FN14途徑可促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子P65的磷酸化并增加UAPs的表達(dá),進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞收縮力。在整體動(dòng)物水平進(jìn)一步證實(shí),抑制FN14可以明顯推遲小鼠正常分娩的發(fā)生。提示TWEAK-FN14可能通過激活NFκB通路參與分娩啟動(dòng)。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R714.21
【圖文】：

學(xué)碩士學(xué)位論文實(shí)驗(yàn)結(jié)果一節(jié) 人妊娠相關(guān)組織中 Furin 的表達(dá)及分布人足月未臨產(chǎn)和足月臨產(chǎn)子宮肌組織全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)と俗阍挛磁R產(chǎn)與足月臨產(chǎn)子宮肌組織中的差異基因，我們收集臨床足足月臨產(chǎn)各十例人子宮肌組織樣本進(jìn)行第二代測(cè)序。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在足月肌里 Furin、SULF1 以及 FN14 等基因的表達(dá)較足月未臨產(chǎn)均有顯著升

Furin 在分娩啟動(dòng)中的作用及其機(jī)制研究- 29 -圖2. 人足月未臨產(chǎn)和足月臨產(chǎn)的子宮肌中SULF1、Furin、HIF1A等 mRNA水平的表達(dá)。（A-D，G）RT-PCR 結(jié)果顯示人足月臨產(chǎn)時(shí) SULF1、Furin、FN14、NNMT 及 INMT mRNA 水平表達(dá)上調(diào)；（E-F）RT-PCR 結(jié)果顯示人足月未臨產(chǎn)與臨產(chǎn) NNMT 和 TBSH mRNA 水平表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。n=9 , E: P=0.62, F: P=0.22 , * P<0.05, ** P<0.01, ***P<0.001.Fig 2. The level of SULF1、Furin、HIF1A mRNA in myometrium during human pregnancy andlabor. (A-D,G) The level of SULF1, Furin, FN14, NNMT and INMT mRNA were up-regulated inhuman term labor; (E-F) The level of TBSH and HIF1A mRNA were not significantly differentbetween the two groups. Data are presented as mean±SEM. n=9 in each group. E: P=0.62, F: P=0.22 ,*P<0.05,** P<0.01, ***P<0.001 compared with pregnant women who are non-labor.二、人足月未臨產(chǎn)和足月臨產(chǎn)子宮肌組織中 PCs 表達(dá)（一）人足月未臨產(chǎn)及足月臨產(chǎn)子宮肌中 PCs 其他成員 mRNA水平的表達(dá)RNA-seq 結(jié)果表明 Furin、SULF1 及 FN14 在足月未臨產(chǎn)和臨產(chǎn)間表達(dá)存在顯著差異，同時(shí) RT-PCR 結(jié)果顯示 Furin、SULF1 及 FN14 mRNA 水平在臨產(chǎn)時(shí)顯著上調(diào)。而 Furin 又可剪切活化 SULF1, 同時(shí) FN14 的配體 TWEAK 也可被 Furin 剪切活化，于是我們推測(cè) Furin 在分娩啟動(dòng)中起了重要作用，F(xiàn)urin 便成了我們研究的重點(diǎn)�？�

海軍軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文慮到前蛋白轉(zhuǎn)化酶家族各成員間較高的同源性，為探明 PCs 家族其他成員在人類妊娠過程子宮肌中 mRNA 表達(dá)情況，我們從臨床收集足月未臨產(chǎn)以及足月臨產(chǎn)人子宮肌樣本，抽提組織總 RNA, 進(jìn)行 RT-PCR 檢測(cè)各成員表達(dá)情況。結(jié)果顯示，其他成員表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖 3）。

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本文編號(hào)：2764460