發(fā)布時間：2020-07-15 03:07

【摘要】：目的:應用生物信息學方法分析hsa-mi R-429的基本信息,預測其靶基因,對其靶基因進行功能注釋,為探索其在卵巢癌治療方面的機制研究作理論基礎(chǔ)。方法:利用從mi RDB、Targetscan、Target Miner、RNACentral四個預測軟件和Satrbase v3.0數(shù)據(jù)庫平臺預測到的hsa-mi R-429的靶基因,并通過GEO數(shù)據(jù)庫檢索到有關(guān)mi R-429靶基因的芯片數(shù)據(jù)庫GSE56967進行靶基因分析,將預測到的靶基因進行GO功能注釋。結(jié)果:四個預測軟件同期預測到25個hsa-mi R-429的靶基因,在Satrbase v3.0數(shù)據(jù)庫平臺中預測出7個預測靶基因(ZEB1、ATP2A2、NAB1、VLDLR、CHD1、SEC23A、FRMD4B);在GEO數(shù)據(jù)庫中搜索卵巢癌與mi R-429有關(guān)的數(shù)據(jù)芯片,結(jié)果顯示,mi R-429過表達會介導ZEB1下調(diào)。而預測到的hsa-mi R-429的靶基因在胚胎器官發(fā)育、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、MAPK家族信號通路的調(diào)控、信號調(diào)節(jié)、信號傳導、脂質(zhì)代謝等生物學過程具有富集表現(xiàn)(P0.05)。結(jié)合前期研究中卵巢癌與mi RNA的差異表達譜相關(guān)的臨床數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)mi R-429在卵巢癌耐藥組中下調(diào)0.35倍,mi R-429及其靶基因ZEB2和KANK2的差異表達亦與患者OS和PFS相關(guān)。結(jié)論:hsa-mi R-429可能調(diào)控多種靶基因,而ZEB1、ATP2A2、NAB1、VLDLR、CHD1、SEC23A、FRMD4B可能是發(fā)揮關(guān)鍵作用的基因;同時在與卵巢癌相關(guān)方面,轉(zhuǎn)錄調(diào)控、MAPK家族信號通路的調(diào)控、信號調(diào)節(jié)、信號傳導又可能是hsa-mi R-429靶基因群關(guān)鍵的調(diào)節(jié)機制所在,后續(xù)將同期對這些靶基因進行實驗和臨床的驗證。目的:前期研究表明mi R-429的靶基因可能是ZEB1,以此探討卵巢癌耐藥細胞系及裸鼠移植瘤中ZEB1的表達水平。方法:慢病毒感染靶細胞;熒光定量PCR檢測SKOV3、SKOV3/DDP2、SKOV3/DDP2-mi R-429mimics、SKOV3/DDP2-mi R-NC、SKOV3/DDP2-mi R-429inhibitor細胞中mi R-429的表達水平分析;將SKOV3、SKOV3/DDP2、SKOV3/DDP2-mi R-429mimics、SKOV3/DDP2-mi R-NC、SKOV3/DDP2-mi R-429inhibitor細胞移植入小鼠皮下,監(jiān)測移植瘤的生長情況;q RT-PCR檢測移植瘤組織的mi R-429表達;免疫組化觀察裸鼠移植瘤ZEB1的表達;HE(蘇木素-伊紅)染色觀察裸鼠移植瘤的細胞形態(tài)。結(jié)果:SKOV3/DDP2-mi R-429mimic移植瘤與對照組移植瘤相比,腫瘤生長速度緩慢;mi R-429在移植瘤SKOV3/DDP2-mi R-429m imics中呈高表達;免疫組化檢測發(fā)現(xiàn),五種移植瘤中ZEB1的表達隨順鉑的注射次數(shù)的增加而減弱,且移植瘤SKOV3/DDP2-mi R-429mimics中ZEB1的表達程度低于對照組移植瘤。結(jié)論:在裸鼠移植瘤研究中,mi R-429可以靶向作用于ZEB1,mi R-429的上調(diào)對ZEB1基因的表達有抑制作用。目的:探索mi R-429過表達后在卵巢癌順鉑耐藥株SKOV3/DDP2自噬過程的變化,以及對PI3K-AKT1自噬通路的影響,并采用裸鼠體內(nèi)實驗驗證。方法:CCK8檢測SKOV3/DDP2和親本細胞SKOV3的IC50及SKOV3/DDP2的耐藥指數(shù);CCK8檢測SKOV3/DDP2、SKOV3/DDP2-mi R-429mi mics、SKOV3/DDP2-mi R-NC、SKOV3/DDP2-mi R-429inhibitor細胞的IC50值;免疫熒光觀察不同濃度順鉑作用24小時細胞內(nèi)自噬蛋白LC3A/B分布的影響;透射電鏡觀察一定順鉑濃度作用24小時細胞內(nèi)的自噬小體;West ern Bolt檢測不同順鉑濃度作用24小時細胞內(nèi)自噬蛋白(LC3A/B-II)/(LC3A/B-I)、p62的表達;Western Bolt檢測mi R-429過表達影響卵巢癌細胞中PI3K-AKT1通路的表達;Western Bolt檢測移植瘤內(nèi)自噬蛋白(LC3A/B-II)/(LC3A/B-I)、p62的表達;HE(蘇木素-伊紅)染色觀察裸鼠移植瘤;免疫組化觀察裸鼠移植瘤中LC3B的表達。結(jié)果:順鉑誘導后,mi R-429過表達耐藥株mimics透射電鏡未見自噬體形成;一定濃度順鉑作用后,Western Bolt顯示mimics細胞(LC3A/B-II)/(LC3A/B-I)比值降低,p62升高;SKOV3/DDP2-mi R-429mimics在PI3K-AKT1自噬通路中AKT1、p-AKT1、m TOR、p-m TOR的表達增高,同時,SKOV3/DDP2-mi R-429inhibitor中Atg7和AM PK的表達上調(diào)。裸鼠體內(nèi)實驗中,Western Bolt檢測SKOV3/DDP2-mi R-429mimics裸鼠瘤的LC3A/B的表達比對照組低。結(jié)論:mi R-429過表達能在SKOV3/DDP2細胞中減弱順鉑誘導產(chǎn)生的自噬,同時增加順鉑耐藥細胞的敏感性,并且mi R-429在卵巢癌耐藥細胞中過表達能有效的抑制耐藥腫瘤生長,減弱順鉑誘導的自噬。因此,進一步研究mi R-429介導自噬對卵巢癌耐藥發(fā)展過程中的信號傳導通路機制研究及其在臨床中的應用提供了重要的指導意義。
【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R737.31
【圖文】：

圖 1-1 hsa-miR-429 基因序列號Figure 1-1 gene sequence number of hsa-miR-429圖 1-2 hsa-miR-429 在人類基因組中成熟染色體Figure 1-2 mature chromosomes of hsa-miR-429 in the human genome

調(diào)控自噬增強鉑類耐藥卵巢上皮癌細胞敏感性的機制研究 2019屆碩士圖 1-1 hsa-miR-429 基因序列號Figure 1-1 gene sequence number of hsa-miR-429

圖 1-3 hsa-miR-429 在人類基因組中成熟位點Figure 1-3 mature site of hsa-miR-429 in human genome圖 1-4 miR-429 預測的靶基因Figure 1-4 predicted target genes of miR-429

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