【摘要】：目的多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是育齡期女性常見(jiàn)的生殖內(nèi)分泌疾病,常伴有代謝障礙,近80%的PCOS患者合并有不同程度的胰島素抵抗(polycystic ovary syndrome with insulin resistance,PCOS-IR)。本課題組采用高通量基因測(cè)序技術(shù),篩選出SD雌性大鼠PCOS-IR模型較相應(yīng)的對(duì)照組模型卵巢組織特異性高表達(dá)的miR-136-3p,預(yù)測(cè)其潛在靶基因胰島素受體底物1(insulin receptor substrate 1,IRS-1),并初步闡明miR-136-3p通過(guò)調(diào)控IRS-1調(diào)控其下游磷脂酰肌酐-3激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B,PI3K/AKT)通路的機(jī)制。我們將miR-136-3p轉(zhuǎn)染至人卵巢顆粒細(xì)胞瘤細(xì)胞(kartogenin,KGN細(xì)胞)及人腎上皮細(xì)胞(293T細(xì)胞),為進(jìn)一步研究miR-136-3p在細(xì)胞中調(diào)控IRS-1/PI3K/AKT信號(hào)通路參與PCOS-IR的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。方法(1)使用高通量基因測(cè)序技術(shù),分析PCOS-IR組大鼠及對(duì)照組大鼠卵巢中差異微小核糖核酸(microRNAs,miRNAs)的表達(dá)譜,最后利用生物信息學(xué)方法篩選出PCOS-IR組特異性高表達(dá)的miRNAs及其生物預(yù)測(cè)潛在靶基因;(2)miR-136-3p的表達(dá)水平及其與IRS-1/PI3K/AKT通路的關(guān)系:1)使用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法分析兩組大鼠卵巢組織中miR-136-3p、IRS-1 mRNA表達(dá)水平;2)采用Western blot方法分析兩組大鼠卵巢組織中IRS-1、PI3K、AKT、磷酸化磷脂酰肌酐-3激酶(phosphorylated phosphoinositide 3-kinase,pPI3K)和磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B,pAKT)的蛋白表達(dá)水平。(3)觀察miR-136-3p及其不同濃度對(duì)KGN細(xì)胞及293T細(xì)胞的作用:將miR-136-3p模擬物(mimic)和抑制物(inhibitor)的轉(zhuǎn)染試劑設(shè)計(jì)成不同的梯度濃度后,轉(zhuǎn)染至KGN細(xì)胞及293T細(xì)胞內(nèi),觀察增強(qiáng)或抑制miR-136-3p及不同濃度miR-136-3p在KGN細(xì)胞及293T細(xì)胞中對(duì)IRS-1 mRNA表達(dá)水平的影響及IRS-1、PI3K、AKT、pPI3K、pAKT蛋白表達(dá)水平的影響。(4)觀察IRS-1/PI3K/AKT通路之間的蛋白相互作用:使用免疫共沉淀(co immunoprecipitation,COIP)磁珠法,檢測(cè)IRS-1、pPI3K、pAKT蛋白之間的直接作用。結(jié)果(1)兩組大鼠卵巢組織高通量基因測(cè)序結(jié)果顯示:PCOS-IR組中的miR-136-3p明顯高于對(duì)照組。我們使用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)其生物預(yù)測(cè)靶基因?yàn)镮RS-1,相關(guān)GO分析及KEGG分析顯示其與PI3K/AKT通路密切相關(guān)。(2)RT-PCR實(shí)驗(yàn)顯示:1)PCOS-IR組中的miR-136-3p mRNA表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組,IRS-1 mRNA表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組(P0.05);2)miR-136-3p mimic轉(zhuǎn)染KGN細(xì)胞及293T細(xì)胞48 h后,IRS-1 mRNA表達(dá)水平均明顯低于對(duì)照組(兩組細(xì)胞P均0.05),inhibitor組結(jié)果相反。(3)Western blot結(jié)果顯示:1)PCOS-IR組大鼠卵巢組織IRS-1、pPI3K、pAKT表達(dá)水平均明顯低于對(duì)照組(P0.05);2)miR-136-3p mimic轉(zhuǎn)染KGN細(xì)胞及293T細(xì)胞48 h后,IRS-1、pPI3K、pAkt的蛋白表達(dá)水平均明顯低于對(duì)照組(兩組細(xì)胞P均0.05),inhibitor組結(jié)果則相反;3)不同梯度濃度的miR-136-3p mimic轉(zhuǎn)染KGN細(xì)胞及293T細(xì)胞48 h后,IRS-1、pPI3K、pAKT的蛋白表達(dá)水平均明顯低于對(duì)照組,且隨著梯度的增加,此三種基因的蛋白表達(dá)量均明顯下降(兩組細(xì)胞P均0.05),inhibitor組則升高。(4)COIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:IRS-1與pPI3K蛋白之間存在直接作用。結(jié)論(1)IRS-1/PI3K/AKT信號(hào)通路是miR-136-3p參與PCOS大鼠卵巢和顆粒細(xì)胞IR作用機(jī)制的途徑之一。(2)IRS-1與pPI3K蛋白直接作用,與PI3K/AKT共同構(gòu)成胰島素分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
【學(xué)位授予單位】：廣州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R711.75
【圖文】：

廣州醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文結(jié)果1. PCOS-IR 大鼠卵巢組織的生物信息學(xué)分析1.1 miR-136-3p 在 PCOS-IR 大鼠卵巢中的表達(dá)水平為研究 miR-136-3p 在 PCOS-IR 組大鼠卵巢中的表達(dá)情況，我們利用兩組大鼠（對(duì)照組與 PCOS-IR 組）的兩對(duì)卵巢進(jìn)行高通量基因測(cè)序及聚類(lèi)分析，結(jié)果如圖 1 所示。

2. miR-136-3p 與靶基因的相關(guān)性。A). 在大鼠中，miR-136-3p 與 IRS-1 堿基序列比miR-136-3p 與 IRS-1 的部分核苷酸之間形成堿基互補(bǔ)，存在著結(jié)合區(qū)域；B). 紅色顯示 miR-136-3p 的序列在哺乳動(dòng)物中高度保守，具有同源性。Figure 2. The correlation between miR-136-3p and its target gene. A). The alignment oR-136-3p with IRS-1 indicates that miR-136-3p forms a base complementation with a pcleotide of IRS-1, where a binding region exists; B). The red box shows that the miR-13are highly conserved and homologous in mammals. miR-136-3p 靶基因蛋白富集分析為了解 miR-136-3p 在 PCOS-IR 大鼠卵巢中發(fā)揮作用時(shí)可能參與的相關(guān)，我們采用了 KEGG 分析、GO 分析和構(gòu)建靶基因 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖對(duì) miR-1關(guān)靶基因之間聯(lián)系和蛋白富集情況進(jìn)行研究。結(jié)果如圖 3 所示。

亡日甩巴二幾由笠曲朋栩

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 陶_";王麗華;;多囊卵巢綜合征診治內(nèi)分泌專(zhuān)家共識(shí)[J];中華內(nèi)分泌代謝雜志;2018年01期

2 ;多囊卵巢綜合征中國(guó)診療指南[J];中華婦產(chǎn)科雜志;2018年01期

本文編號(hào)：2748628