【摘要】：研究背景和目的:控制性卵巢刺激(controlled ovarian stimulation,COS)是輔助生殖技術(assisted reproductive technology,ART)獲得一定數(shù)量卵母細胞的基礎。但它也使母體在配子及早期胚胎發(fā)育階段暴露于一個遠高于生理的高雌激素環(huán)境。我們團隊的前期研究發(fā)現(xiàn),母體早期的高雌激素暴露可導致子代低出生體重及小于胎齡兒(small-for-gestational-age,SG A)的風險增加。但其具體機制目前尚不明確。雌激素暴露可通過受體后信號通路影響DNA甲基化等表觀遺傳修飾,干擾基因表達。胎盤中有許多與生長發(fā)育相關的印記基因,其表達受相應印記調控區(qū)DNA甲基化調節(jié)。我們的前期研究發(fā)現(xiàn),ART子代胎盤中印記基因CDKN1 C及IGF2的mRN A表達顯著上調,其相應印記調控區(qū)KvDMR1及H19DMR的DNA甲基化水平也發(fā)生顯著改變,但這些改變是否與母體高雌激素暴露相關目前尚不明確。本研究比較經(jīng)ART新鮮胚胎移植妊娠子代與自然妊娠子代的出生體重及其與母體取卵前HCG注射日血清雌激素(estradiol,E2)水平的相關性,探索母體高雌激素暴露對子代出生體重的影響。再以不同濃度的雌激素處理人絨毛滋養(yǎng)細胞系HTR8,研究雌激素對滋養(yǎng)細胞中CDKIN1C及IGF2表達的影響及其相應印記調控區(qū)KvDMRI及H19 DMR的DNA甲基化狀態(tài)。探索高雌激素暴露與胎盤滋養(yǎng)細胞中生長發(fā)育相關印記基因表達改變的相關性,以期闡明ART所致高雌激素暴露影響子代出生體重的機制。研究方法:1.回顧性分析比較1023例經(jīng)ART新鮮胚胎移植妊娠子代與1226例自然妊娠子代的出生體重,并按母體取卵前HCG注射日血清雌激素水平的中位數(shù)對兩組子代的出生體重進行分層比較,探索母體高雌激素暴露對子代出生體重的影響。2.在體外以不同濃度的雌激素(0,10-9,10-7,10-5 mol/L)處理人絨毛滋養(yǎng)細胞系HTR8,模擬體內生理及超生理濃度雌激素對人絨毛滋養(yǎng)細胞的影響。3.應用實時逆轉錄 PCR 技術(Quantitative Real-time RT-PCR,RT-qPCR)研究不同濃度雌激素對滋養(yǎng)細胞中CDKN1C及IGF2表達的影響。4.用亞硫酸鹽測序(bisulfite sequencing,BSP)的方法研究目的基因相應印記調控區(qū)KvDMR1及H19 DMR的DNA甲基化狀態(tài)。結果1.ART組與自然妊娠組出生體重比較及其與母體HCG注射日雌激素的相關性ART組子代平均出生體重低于自然妊娠組,但無顯著性差異(P0.05)。但當我們根據(jù)HCG注射日母體血清雌二醇的中位數(shù)(9974pmol/L)將ART組分為高雌激素組(E29,974pmol/L)和低雌激素組(E2≤9,974pmol/L)時,高雌激素組子代的出生體重則顯著低于低雌激素組及自然妊娠組(p0.05)。2.不同濃度雌激素處理對HTR8中CDKN1C及IGF2基因mRNA表達的影響用10-5 mol/L雌二醇處理24小時(h)或用≥10-9 mol/L雌二醇處理48h均能顯著上調HTR8中CDKKN1C的mRNA表達水平(p0.01)。雌二醇處理24h并不改變HTR8中IGF2的mRNA表達水平,但10-5 mol/L雌二醇處理48h可顯著上調HTR8中IGF2的mRNA表達水平(p0.05)。3.不同濃度雌激素處理對HTR8中目的基因相應印記調控區(qū)KvDMR1及H19 DMR DNA甲基化水平的影響。用10-5 mol/L雌二醇處理24 h或用≥10-7 mol/L雌二醇處理48h均能顯著下調HTR8中KvDMR1的DNA甲基化水平(p0.01)。雌二醇處理24h并不改變HTR8中H19 DMR的DNA甲基化水平,但10-5 mol/L雌二醇處理48h可顯著上調HTR8中H19 DMR的DNA甲基化水平(p0.05)。結論1.母體HCG注射日較高的雌二醇水平(E29,974pmol/L)可顯著下調經(jīng)新鮮胚胎移植妊娠子代的出生體重。2.超生理濃度的雌激素處理人絨毛滋養(yǎng)細胞HTR8可顯著上調生長發(fā)育相關印記基因CDKN1C及IGF2的表達。并顯著改變其相應印記調控區(qū)的DNA甲基化水平。3.結合前期研究結果“ART子代胎盤中CDKN1C及IGF2表達上調,其印記調控區(qū)的DNA甲基化狀態(tài)也發(fā)生相應變化”,我們認為,ART所導致的胚胎高雌激素暴露通過人類絨毛滋養(yǎng)細胞中印記調控區(qū)的DNA甲基化干擾生長發(fā)育相關印記基因CDKN1C及IGF2的表達,從而影響子代出生體重。
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R714.8
【圖文】：

目的片段擴增后用融解曲線驗證擴增產(chǎn)物的特異性，如果產(chǎn)物是特異性擴增，逡逑融解曲線就會出現(xiàn)一尖峰；如果有引物二聚體或非特異性擴增，就會出現(xiàn)多個尖逡逑峰（見圖４．２）。逡逑１９逡逑

圖４．２融解曲線逡逑用ＵＴ５ｍｏｌ／Ｌ雌二醇處理２４小時（ｈ）或用￥；１０＿９ｍｏｌ／Ｌ雌二醇處理４８ｈ均能顯逡逑著上調ＨＴＲ８中ＣＤ尺Ａ７Ｃ的ｍＲＮＡ表達水平（ｐ＜０．０１）（見圖４．３）。雌二醇處理逡逑２４ｈ并不改變ＨＴＲ８中／ＧＦ２的ｍＲＮＡ表達水平，但ｌ（Ｔ５ｍｏｌ／Ｌ雌二醇處理４８ｈ可逡逑顯著上調ＨＴＲ８中／ＧＦ２的ｍＲＮＡ表達水平（ｐ＜０．０５）（見圖４．４）。逡逑２０逡逑

圖４．３不同濃度（０，丨０—９，邋１邋（Ｔ７，邋１邋（Ｔ５邋ｍｏｌ／Ｌ）雌激素分別處理２４ｈ及４８ｈ對ＨＴＲ８中逡逑ＣＸ＾ＷＣｍＲＮＡ表達的影響（結果用均數(shù)±標準誤表示；＊＊／？＜０．０１與處理２４ｈ空白逡逑

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本文編號：2743321