【摘要】：研究背景和目的:控制性卵巢刺激(controlled ovarian stimulation,COS)是輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technology,ART)獲得一定數(shù)量卵母細(xì)胞的基礎(chǔ)。但它也使母體在配子及早期胚胎發(fā)育階段暴露于一個(gè)遠(yuǎn)高于生理的高雌激素環(huán)境。我們團(tuán)隊(duì)的前期研究發(fā)現(xiàn),母體早期的高雌激素暴露可導(dǎo)致子代低出生體重及小于胎齡兒(small-for-gestational-age,SG A)的風(fēng)險(xiǎn)增加。但其具體機(jī)制目前尚不明確。雌激素暴露可通過受體后信號通路影響DNA甲基化等表觀遺傳修飾,干擾基因表達(dá)。胎盤中有許多與生長發(fā)育相關(guān)的印記基因,其表達(dá)受相應(yīng)印記調(diào)控區(qū)DNA甲基化調(diào)節(jié)。我們的前期研究發(fā)現(xiàn),ART子代胎盤中印記基因CDKN1 C及IGF2的mRN A表達(dá)顯著上調(diào),其相應(yīng)印記調(diào)控區(qū)KvDMR1及H19DMR的DNA甲基化水平也發(fā)生顯著改變,但這些改變是否與母體高雌激素暴露相關(guān)目前尚不明確。本研究比較經(jīng)ART新鮮胚胎移植妊娠子代與自然妊娠子代的出生體重及其與母體取卵前HCG注射日血清雌激素(estradiol,E2)水平的相關(guān)性,探索母體高雌激素暴露對子代出生體重的影響。再以不同濃度的雌激素處理人絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞系HTR8,研究雌激素對滋養(yǎng)細(xì)胞中CDKIN1C及IGF2表達(dá)的影響及其相應(yīng)印記調(diào)控區(qū)KvDMRI及H19 DMR的DNA甲基化狀態(tài)。探索高雌激素暴露與胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中生長發(fā)育相關(guān)印記基因表達(dá)改變的相關(guān)性,以期闡明ART所致高雌激素暴露影響子代出生體重的機(jī)制。研究方法:1.回顧性分析比較1023例經(jīng)ART新鮮胚胎移植妊娠子代與1226例自然妊娠子代的出生體重,并按母體取卵前HCG注射日血清雌激素水平的中位數(shù)對兩組子代的出生體重進(jìn)行分層比較,探索母體高雌激素暴露對子代出生體重的影響。2.在體外以不同濃度的雌激素(0,10-9,10-7,10-5 mol/L)處理人絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞系HTR8,模擬體內(nèi)生理及超生理濃度雌激素對人絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞的影響。3.應(yīng)用實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄 PCR 技術(shù)(Quantitative Real-time RT-PCR,RT-qPCR)研究不同濃度雌激素對滋養(yǎng)細(xì)胞中CDKN1C及IGF2表達(dá)的影響。4.用亞硫酸鹽測序(bisulfite sequencing,BSP)的方法研究目的基因相應(yīng)印記調(diào)控區(qū)KvDMR1及H19 DMR的DNA甲基化狀態(tài)。結(jié)果1.ART組與自然妊娠組出生體重比較及其與母體HCG注射日雌激素的相關(guān)性ART組子代平均出生體重低于自然妊娠組,但無顯著性差異(P0.05)。但當(dāng)我們根據(jù)HCG注射日母體血清雌二醇的中位數(shù)(9974pmol/L)將ART組分為高雌激素組(E29,974pmol/L)和低雌激素組(E2≤9,974pmol/L)時(shí),高雌激素組子代的出生體重則顯著低于低雌激素組及自然妊娠組(p0.05)。2.不同濃度雌激素處理對HTR8中CDKN1C及IGF2基因mRNA表達(dá)的影響用10-5 mol/L雌二醇處理24小時(shí)(h)或用≥10-9 mol/L雌二醇處理48h均能顯著上調(diào)HTR8中CDKKN1C的mRNA表達(dá)水平(p0.01)。雌二醇處理24h并不改變HTR8中IGF2的mRNA表達(dá)水平,但10-5 mol/L雌二醇處理48h可顯著上調(diào)HTR8中IGF2的mRNA表達(dá)水平(p0.05)。3.不同濃度雌激素處理對HTR8中目的基因相應(yīng)印記調(diào)控區(qū)KvDMR1及H19 DMR DNA甲基化水平的影響。用10-5 mol/L雌二醇處理24 h或用≥10-7 mol/L雌二醇處理48h均能顯著下調(diào)HTR8中KvDMR1的DNA甲基化水平(p0.01)。雌二醇處理24h并不改變HTR8中H19 DMR的DNA甲基化水平,但10-5 mol/L雌二醇處理48h可顯著上調(diào)HTR8中H19 DMR的DNA甲基化水平(p0.05)。結(jié)論1.母體HCG注射日較高的雌二醇水平(E29,974pmol/L)可顯著下調(diào)經(jīng)新鮮胚胎移植妊娠子代的出生體重。2.超生理濃度的雌激素處理人絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞HTR8可顯著上調(diào)生長發(fā)育相關(guān)印記基因CDKN1C及IGF2的表達(dá)。并顯著改變其相應(yīng)印記調(diào)控區(qū)的DNA甲基化水平。3.結(jié)合前期研究結(jié)果“ART子代胎盤中CDKN1C及IGF2表達(dá)上調(diào),其印記調(diào)控區(qū)的DNA甲基化狀態(tài)也發(fā)生相應(yīng)變化”,我們認(rèn)為,ART所導(dǎo)致的胚胎高雌激素暴露通過人類絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞中印記調(diào)控區(qū)的DNA甲基化干擾生長發(fā)育相關(guān)印記基因CDKN1C及IGF2的表達(dá),從而影響子代出生體重。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R714.8
【圖文】：

目的片段擴(kuò)增后用融解曲線驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，如果產(chǎn)物是特異性擴(kuò)增，逡逑融解曲線就會出現(xiàn)一尖峰；如果有引物二聚體或非特異性擴(kuò)增，就會出現(xiàn)多個(gè)尖逡逑峰（見圖４．２）。逡逑１９逡逑

圖４．２融解曲線逡逑用ＵＴ５ｍｏｌ／Ｌ雌二醇處理２４小時(shí)（ｈ）或用￥；１０＿９ｍｏｌ／Ｌ雌二醇處理４８ｈ均能顯逡逑著上調(diào)ＨＴＲ８中ＣＤ尺Ａ７Ｃ的ｍＲＮＡ表達(dá)水平（ｐ＜０．０１）（見圖４．３）。雌二醇處理逡逑２４ｈ并不改變ＨＴＲ８中／ＧＦ２的ｍＲＮＡ表達(dá)水平，但ｌ（Ｔ５ｍｏｌ／Ｌ雌二醇處理４８ｈ可逡逑顯著上調(diào)ＨＴＲ８中／ＧＦ２的ｍＲＮＡ表達(dá)水平（ｐ＜０．０５）（見圖４．４）。逡逑２０逡逑

圖４．３不同濃度（０，丨０—９，邋１邋（Ｔ７，邋１邋（Ｔ５邋ｍｏｌ／Ｌ）雌激素分別處理２４ｈ及４８ｈ對ＨＴＲ８中逡逑ＣＸ＾ＷＣｍＲＮＡ表達(dá)的影響（結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示；＊＊／？＜０．０１與處理２４ｈ空白逡逑

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本文編號：2743321