【摘要】：目的探究環(huán)氧合酶-2(COX-2)抑制劑塞來昔布增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞紫杉醇和順鉑化療敏感性的作用及線粒體P糖蛋白(P-gp)相關(guān)的分子機(jī)制。方法1.MTT實(shí)驗(yàn)檢測塞來昔布短期(48 h)單藥及與紫杉醇或順鉑聯(lián)用對(duì)卵巢癌細(xì)胞株A2780及其紫杉醇耐藥株A2780T的生長抑制作用。2.流式細(xì)胞術(shù)檢測塞來昔布單藥及與紫杉醇或順鉑聯(lián)用(48 h)對(duì)A2780T細(xì)胞凋亡的影響;克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測塞來昔布在長期(10-14 d)低濃度(10μM)和高濃度(100μM)下單藥及與紫杉醇或順鉑聯(lián)用對(duì)A2780T細(xì)胞克隆形成的影響。3.塞來昔布(濃度梯度)處理耐藥卵巢癌細(xì)胞A2780T后,電子顯微鏡觀察線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化;MitoTracker Deep Red標(biāo)記線粒體后,激光共聚焦顯微鏡觀察多藥耐藥蛋白P-gp表達(dá)和線粒體分布的變化。4.密度梯度離心法提取耐藥卵巢癌細(xì)胞A2780T和其親本株A2780細(xì)胞線粒體,免疫印跡法(WB)檢測提取線粒體的完整性和純度,流式細(xì)胞術(shù)檢測在細(xì)胞外塞來昔布對(duì)線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)羅丹明123(Rho123)功能的影響。5.塞來昔布(濃度梯度,時(shí)間梯度)處理耐藥卵巢癌細(xì)胞A2780T后,實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測多藥耐藥基因Mdr-1在轉(zhuǎn)錄水平的變化;免疫印跡法(WB)檢測P-gp蛋白在全細(xì)胞水平表達(dá)的變化;塞來昔布(濃度梯度)處理耐藥卵巢癌細(xì)胞A2780T后,提取線粒體,WB檢測P-gp蛋白在線粒體水平表達(dá)的變化。6.塞來昔布單藥及與紫杉醇或順鉑聯(lián)用處理A2780T細(xì)胞,WB檢測凋亡相關(guān)因子caspase-3,Bcl-2,Bax,PARP等蛋白水平表達(dá)變化。結(jié)果1.在藥物短期(48 h)作用時(shí),塞來昔布單一用藥在高濃度(100μM)下抑制A2780T、A2780細(xì)胞的生長(p0.05),而低濃度(10μM)作用不明顯;同樣,在與紫杉醇或順鉑聯(lián)用時(shí),只有高濃度(100μM)塞來昔布才會(huì)在短期內(nèi)(48 h)增強(qiáng)兩種化療藥對(duì)兩種卵巢癌細(xì)胞株的生長抑制作用(p0.05)。2.塞來昔布單藥短期(48 h)作用時(shí),隨著藥物濃度增加,A2780T細(xì)胞凋亡增加。高濃度塞來昔布(100μM)與紫杉醇或順鉑聯(lián)用時(shí),A2780T細(xì)胞凋亡增加(p0.01),但是低濃度(10μM)塞來昔布聯(lián)合用藥A2780T細(xì)胞的凋亡無顯著增加(p0.05)。然而,無論低濃度(10μM)還是高濃度(100μM)塞來昔布長期(10-14 d)作用均可使A2780T細(xì)胞的克隆形成明顯減少(p0.01,p0.001)。3.塞來昔布使A2780T細(xì)胞線粒體出現(xiàn)腫脹、嵴結(jié)構(gòu)消失等凋亡前狀態(tài)并促進(jìn)線粒體向細(xì)胞核周圍聚集。4.密度梯度離心法所提取線粒體純度高,完整性好;流式細(xì)胞檢測A2780T細(xì)胞線粒體對(duì)Rho123的外排率發(fā)現(xiàn),與未處理組(64.77%)相比,塞來昔布預(yù)處理組外排率為31.6%,與P-gp特異性抑制劑環(huán)孢素A預(yù)處理后(19.71%)作用相似。5.在細(xì)胞水平,塞來昔布可顯著抑制Mdr-1基因的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá),這種抑制作用呈濃度時(shí)間非依賴性。在線粒體水平,塞來昔布抑制P-gp蛋白表達(dá)。6.塞來昔布使caspase-3激活增加,與紫杉醇聯(lián)用PARP激活顯著增加,且與順鉑聯(lián)用Bcl-2的表達(dá)顯著降低。結(jié)論塞來昔布增強(qiáng)耐藥卵巢癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇和順鉑的化療敏感性,其作用可能是通過抑制線粒體表面P-gp的表達(dá)和功能導(dǎo)致線粒體穩(wěn)態(tài)失衡從而啟動(dòng)線粒體凋亡通路實(shí)現(xiàn)。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R737.31
【圖文】：

MTT 法檢測其對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性作用，發(fā)現(xiàn) 100 μM 以下濃度塞來昔布對(duì)腫瘤細(xì)胞毒性作用�。▓D 1A）。100 μM 塞來昔布作用 A2780、A2780T 細(xì)胞 48h 后，細(xì)胞生存率分別為為 0.81±0.04；0.78±0.04。對(duì)于親本卵巢癌細(xì)胞株 A2780 來說，低濃度紫杉醇 0.05μM 或順鉑 4μM 即可對(duì)其產(chǎn)生一定的殺傷作用，而與塞來昔布 100μM 聯(lián)用仍可進(jìn)一步對(duì)其產(chǎn)生明顯的生長抑制作用，顯著降低腫瘤細(xì)胞的生存率（圖 1C）；而對(duì)于獲得性紫杉醇耐藥卵巢癌細(xì)胞株 A2780T，較高濃度的紫杉醇（30μM）或順鉑（15μM）對(duì)其殺傷作用仍不明顯，但是與塞來昔布（100μM）聯(lián)用后 A2780T 細(xì)胞的生長抑制作用顯著增強(qiáng)（圖 1B）。由于腫瘤耐藥是目前臨床化療失敗的重要因素，增加化療藥物劑量伴隨著藥物毒性的顯著增加，而安全濃度下的紫杉醇對(duì)敏感細(xì)胞已經(jīng)有顯著的殺傷作用（數(shù)據(jù)未顯示），故接下來我們的實(shí)驗(yàn)主要圍繞塞來昔布對(duì)耐藥卵巢癌細(xì)胞 A2780T 的生長抑制作用及其機(jī)制進(jìn)行研究。

再分別加入紫杉醇（30μM）或順鉑（15μM）組 A2780T 細(xì)胞的凋亡率顯著增加（圖2B，D）。因我們使用的塞來昔布抑制細(xì)胞生長或凋亡的有效濃度（100 μM）遠(yuǎn)大于臨床上每天口服 400mg 所達(dá)到的血藥濃度（10 μM）�？紤]到塞來昔布在臨床上是連續(xù)給藥，而紫杉醇和順鉑等化療藥是周期間歇給藥。根據(jù)這一特點(diǎn)，我們采用克隆形成實(shí)驗(yàn)分析分別長期（10-14d）給予低濃度（10μM）、高濃度（100μM）塞來昔布觀察其對(duì) A2780T 細(xì)胞集落形成的影響。給藥方式如下：塞來昔布單藥組持續(xù)給予含相應(yīng)濃度塞來昔布的培養(yǎng)基；紫杉醇或順鉑單藥組分別加入加入紫杉醇（30 μM）或順鉑（15μM）處理 48h 后，更換新鮮培養(yǎng)基持續(xù)培養(yǎng)；塞來昔布聯(lián)合紫杉醇或順鉑組首先給予塞來昔布預(yù)處理 3h，再分別加入紫杉醇（30 μM）或順鉑（15μM），48h 后撤化療藥，更換為只含塞來昔布的培養(yǎng)基，10-14d 后觀察每組克隆形成情況。如圖 2E，G 所示

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本文編號(hào)：2737228