本文關(guān)鍵詞：子癇前期相關(guān)hsa-miR-18b-5p靶基因的分析驗證，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：子癇前期(preeclampsia,PE)是妊娠期常見特發(fā)疾病,主要在妊娠20周以后出現(xiàn)高血壓、蛋白尿為主的臨床癥狀,在疾病的早期就可發(fā)生全身多器官系統(tǒng)的功能障礙,是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦和圍生兒病死率的重要原因之一[1]。目前PE的病因和病理機制尚未闡明,沒有有效的預(yù)防和治療方法,只能對癥治療或者終止妊娠控制病情發(fā)展,該疾病是妊娠合并癥中疑難解決的問題之一[2]。但從PE的臨床轉(zhuǎn)歸來看,患者終止妊娠后各臨床癥狀迅即得以緩解,表明PE是胎盤相關(guān)性疾病[9]。近年來研究表明,子癇前期胎盤組織中存在差異性表達的微小RNA(micro RNA,mi RNA),它在基因表達調(diào)控中發(fā)揮著重要作用,PE的發(fā)生發(fā)展可能與這些差異性表達mi RNA密切相關(guān)[3-8]。我們實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)mi RNA-18b在PE患者的胎盤組織中是呈病理性低表達的[10],并初步檢測了mi RNA-18b在滋養(yǎng)細胞中的功能[25],但未深入查找mi RNA-18b的靶分子。眾所周知,mi RNA是通過對其靶分子的基因沉默作用發(fā)揮生物學(xué)作用的[37],我們通過靶基因分析初步預(yù)測了mi R-18b的靶基因為低氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α),Karamjit等人在對高原牦牛的HIF-1α基因克隆研究中也提到HIF-1α被預(yù)測是人類mi R-18b的靶基因[11],但未通過實驗證實。有研究表明HIF-1α在子癇前期的胎盤組織中是過表達的[12],這與mi RNA對其相關(guān)靶基因特有的基因沉默調(diào)控趨勢是相符的,由此我們推測mi R-18b可能通過調(diào)控其靶基因HIF-1α的表達從而參與了子癇前期的發(fā)生發(fā)展過程。本實驗擬深入研究兩者的靶向關(guān)系,以便為子癇前期的預(yù)防和治療提供新的方向。目的1.應(yīng)用生物信息學(xué)方法并結(jié)合相關(guān)文獻初步預(yù)測PE相關(guān)的mi R-18b-5p的靶基因為HIF-1α,同時在人絨毛膜滋養(yǎng)細胞層細胞(HTR-8/SVneo)模型中驗證HIF-1α的表達。2.通過熒光素酶報告載體實驗進一步驗證mi R-18b-5p與其靶基因HIF-1α的基因調(diào)控作用,揭示mi R-18b-5p在PE發(fā)生過程中的病理作用。方法1.應(yīng)用靶基因預(yù)測軟件Target Scan、mi RBase等六種方法初步驗證mi R-18b-5p與靶基因HIF-1α的靶向調(diào)控關(guān)系。2.采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(Reverse transcriptase polymerase chain reaction RT-PCR)檢測HTR-8/SVneo細胞系中HIF-1α的表達情況。3.應(yīng)用mi RNA的過表達與抑制技術(shù),在HTR-8/SVneo細胞中過表達與抑制mi R-18b-5p后,采用實時熒光定量PCR技術(shù)(quantificational real-time polymerase chain reaction real-time PCR)和免疫印跡(Western-blot)技術(shù)分別在m RNA水平和蛋白水平驗證mi R-18b-5p與HIF-1α的靶向調(diào)控關(guān)系。4.采用熒光素酶報告基因法,對PE相關(guān)的mi R-18b-5p與其靶基因HIF-1α進行靶點驗證,進一步明確mi R-18b-5p與HIF-1α的負性靶向調(diào)控關(guān)系。結(jié)果1.通過Target Scan等六種靶基因軟件預(yù)測技術(shù)并取其中四種方法的交集,結(jié)果表明mi R-18b-5p與HIF-1α存在靶向調(diào)控。2.RT-PCR技術(shù)結(jié)果表明HTR-8/SVneo細胞系中有HIF-1α的表達。3.在HTR-8/SVneo細胞中過表達與抑制mi R-18b-5p后,real-time PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染mi R-18b-5p mimics的HTR-8細胞中mi R-18b-5p的表達量與對照組相比顯著上升,與對照組相比,轉(zhuǎn)染mimics后的細胞中HIF-1αm RNA表達水平顯著下降,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);轉(zhuǎn)染mi R-18b-5p inhibitor的HTR-8細胞中mi R-18b-5p的表達量與對照組相比顯著下降,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),轉(zhuǎn)染inhibitor后的細胞中HIF-1αm RNA表達水平與對照組相比上升不明顯,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。Western-blot結(jié)果顯示在細胞中過表達mi R-18b-5p后HIF-1α在蛋白水平是顯著降低的,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);在細胞中降調(diào)節(jié)mi R-18b-5p后HIF-1α在蛋白水平是增高不顯著,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。表明mi R-18b-5p與HIF-1α存在負性調(diào)控關(guān)系。4.雙熒光素酶報告基因法結(jié)果顯示:野生型HIF-1α與mi R-18b-5p mimics共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性與對照組相比下降了25%,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);突變型HIF-1α與mi R-18b-5p mimics共轉(zhuǎn)染組與對照組比較差異不明顯,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論1.通過靶基因預(yù)測軟件分析結(jié)果顯示:mi R-18b-5p與HIF-1α之間存在靶向調(diào)控位點并通過實驗驗證人絨毛膜滋養(yǎng)細胞層細胞(HTR-8/SVneo)中有HIF-1α的基礎(chǔ)表達,這為在HTR-8/SVneo細胞中研究mi R-18b-5p與HIF-1α的靶向關(guān)系提供了細胞模型研究的基礎(chǔ)。2.載體實驗驗證結(jié)果顯示,mi R-18b-5p與HIF-1α在m RNA水平和蛋白水平均存在負性靶向調(diào)控作用。在VEGF信號通路中,mi R-18b-5p可能通過調(diào)控靶基因HIF-1ɑ參與了PE發(fā)生的基因調(diào)控過程,這為闡明PE的病理機制奠定了一定的理論和實驗基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：子癇前期 微小RNA 胎盤 低氧誘導(dǎo)因子1α
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R714.244
【目錄】：

• 縮略語表4-5
• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-12
• 前言12-13
• 文獻回顧13-21
• 1 微小RNA的研究進展13-16
• 2 子癇前期16-18
• 3 miRNA與PE相關(guān)性的發(fā)現(xiàn)18-19
• 4 HIF-1α與PE相關(guān)性的研究進展19-21
• 實驗一 hsa-miR-18b-5p靶基因的預(yù)測、篩選和低氧誘導(dǎo)因子HIF-1α在人絨毛膜滋養(yǎng)細胞系HTR-8／SVneo中的表達21-35
• 1 材料21-28
• 2 方法28-31
• 3 結(jié)果31-33
• 4 討論33-35
• 實驗二 hsa-miR-18b-5p靶基因的驗證35-64
• 1 材料35-36
• 2 方法36-51
• 3 結(jié)果51-62
• 4 討論62-64
• 小結(jié)64-65
• 參考文獻65-74
• 個人簡歷和研究成果74-75
• 致謝75-76

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本文編號：273688