【摘要】：目的:近年來研究發(fā)現(xiàn),卵巢癌嚴重威脅著女性的健康,是目前最為棘手的婦科惡性腫瘤之一,其死亡率逐年上升,成為許多女性患者的巨大困擾。研究發(fā)現(xiàn),卵巢癌出現(xiàn)治療效果不理想、患者預(yù)后不良、死亡率高的主要原因是化療過程中容易出現(xiàn)耐藥性。沿著這個思路,進而發(fā)現(xiàn)了腫瘤干細胞(cancer stem cells,CSCs),CSCs是存在于腫瘤細胞中的具有強自我更新、無限增殖及分化潛能的一小群特殊細胞,是腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移和耐藥復(fù)發(fā)的根源。因此,靶向卵巢癌干細胞(Ovarian cancer stem cells,OCSCs),為卵巢癌耐藥機制的研究提供了方向,對于提高卵巢癌治療效果具有重大意義。本文首先從CSCs生長的環(huán)境方面入手,發(fā)現(xiàn)其生存的環(huán)境主要是低氧龕(niche)微環(huán)境,在這種低氧的環(huán)境保護下,使CSCs很難接觸到化療藥,進而也就提高了它們的逃逸能力,這便是CSCs發(fā)生耐藥的機制。我們還發(fā)現(xiàn)低氧條件下有一類廣泛存在于哺乳動物體內(nèi)的重要轉(zhuǎn)錄因子——低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factors,HIFs),HIFs兩個具有生物活性的功能亞基是HIF-1α和HIF-2α。兩者雖然具有高度同源性的結(jié)構(gòu),但是在低氧時激活的轉(zhuǎn)錄因子、組織表達類型以及介導(dǎo)的生物學(xué)功能等方面卻具有特異性。同時有報道稱,HIF-1α和HIF-2α與干細胞干性調(diào)節(jié)有關(guān),尤其是HIF-2α,但目前關(guān)于HIF-2α對OCSCs干性及耐藥性的研究甚少,且其具體作用機制并不清楚,因此,本文重點研究HIF-2α對OCSCs干性及耐藥性的調(diào)節(jié)機制。研究方法:采用無血清非粘附懸浮培養(yǎng)OVCAR-3和CAOV-3卵巢癌細胞誘導(dǎo)卵巢癌球囊細胞。通過CCK-8 assay檢測具有OCSCs樣特性的OVCAR-3S和CAOV-3S卵巢癌球囊細胞對不同濃度的阿霉素adriamycin(ADR)、米托蒽醌mitoxantrone(MX)、紫杉醇paclitaxel(PTX)、依托泊苷etoposide(VP-16)及順鉑Cisplatin(DDP)中的藥物敏感性變化;Western Blot檢測了OVCAR-3S和CAOV-3S與其親本細胞BCRP蛋白的表達水平。通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析379例卵巢癌HIF-2α與BCRP的mRNA表達相關(guān)性,通過免疫組化檢測課題組115例卵巢癌組織這兩種蛋白的表達并分析相關(guān)性;慢病毒轉(zhuǎn)染及篩選構(gòu)建HIF-2α過表達的OVCAR-3和CAOV-3穩(wěn)轉(zhuǎn)卵巢癌細胞株,及HIF-2α沉默的OVCAR-3 S和CAOV-3 S的穩(wěn)轉(zhuǎn)株細胞,分別通過qRT-PCR和Western Blot檢測HIF-2α、BCRP表達。質(zhì)譜和流式檢測細胞對阿霉素的外排能力,考察干擾HIF-2α對卵巢癌干細胞藥物敏感性的影響。基因序列分析BCRP gene啟動子上游2kb區(qū)內(nèi)與HIF-2α結(jié)合的HRE元件,熒光素酶報告基因分析及chip實驗檢測HIF-2α通過HRE元件與BCRP的結(jié)合作用;qRT-PCR檢測干擾HIF-2α后BCRP水平的變化。通過裸鼠皮下接種穩(wěn)轉(zhuǎn)HIF-2α沉默慢病毒的OVCAR-3 MS細胞,構(gòu)建HIF-2α沉默的裸鼠移植瘤模型,考察HIF-2α沉默對裸鼠移植瘤生長及對ADR藥物敏感性的影響;應(yīng)用qRT-PCR檢測各組移植瘤組織HIF-2α及BCRP的mRNA表達情況,免疫組化及Western Blot檢測各組移植瘤組織HIF-2α及BCRP的蛋白表達情況;質(zhì)譜檢測沉默HIF-2α的荷瘤鼠瘤組織內(nèi)ADR含量的變化。結(jié)果:1,OVCAR-3 S和CAOV-3 S細胞與其親本OVCAR-3和CAOV-3細胞比,ADR、MX、PTX、VP-16及DDP的IC_(50)值明顯增高,即對這些化療藥具有明顯的抗藥性;其中,OVCAR-3 S和CAOV-3 S對ADR的抗藥性最強,IC_(50)值分別是OVCAR-3細胞和CAOV-3細胞的(耐藥指數(shù)RI)103.6、24.7倍。在OVCAR-3 S和CAOV-3 S中,BCRP的蛋白表達量分別是親本細胞OVCAR-3和CAOV-3細胞的3.61倍和3.35倍。2,通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析,發(fā)現(xiàn):卵巢癌患者的HIF-2α和BCRP的mRNA的表達明顯的正相關(guān);免疫組化檢測并分析發(fā)現(xiàn)卵巢癌患者病理組織的HIF-2α與BCRP蛋白表達顯著正相關(guān);慢病毒轉(zhuǎn)染shRNA-HIF-2α質(zhì)粒,可沉默OVCAR-3MS和CAOV-3 MS細胞HIF-2α的表達,與sh-NC組比,轉(zhuǎn)染sh-HIF-2α的OVCAR-3 S和CAOV-3 S細胞BCRP的蛋白表達水平均顯著降低;流式檢測發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)的平均熒光強度(MFI)明顯增多,即ADR藥物蓄積明顯增多;質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)ADR含量明顯增多,即對ADR的外排能力降低。與NC-cDNA轉(zhuǎn)染組比,轉(zhuǎn)染HIF-2α-cDNA慢病毒的OVCAR-3和CAOV-3細胞中BCRP的蛋白表達水平均明顯升高;流式檢測發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)平均熒光強度(MFI)明顯降低,即ADR藥物蓄積明顯減少;質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)ADR明顯減少,即對ADR的外排能力增加。3,基因序列分析發(fā)現(xiàn)BCRP gene啟動子上游2kb區(qū)內(nèi)-483到-478區(qū)存在一個可與HIF-2α結(jié)合的HRE元件CACGTG;共轉(zhuǎn)染HIF-2α-cDNA和BCRP啟動子野生型報告基因質(zhì)粒的293T細胞及OVCAR-3細胞酶活性明顯升高,而共轉(zhuǎn)染BCRP啟動子突變型報告基因質(zhì)粒的細胞酶活性無明顯變化;轉(zhuǎn)染HIF-2α-cDNA慢病毒的OVCAR-3細胞與NC-cDNA轉(zhuǎn)染組比,BCRP的mRNA表達水平均明顯升高;轉(zhuǎn)染sh-HIF-2α慢病毒的OVCAR-3 MS和CAOV-3 MS細胞與sh-NC組比,BCRP的mRNA表達水平均顯著降低。結(jié)論:1,無血清非粘附懸浮培養(yǎng)的OVCAR-3 S和CAOV-3 S對ADR等化療耐藥。2,HIF-2α介導(dǎo)OCSCs耐藥且與調(diào)控BCRP的表達及功能有關(guān)。3,在卵巢癌細胞中HIF-2α可與BCRP gene啟動子區(qū)的HRE元件結(jié)合,對BCRP發(fā)揮直接的轉(zhuǎn)錄激活作用。
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R737.31
【圖文】：

圖 2.1 蛋白質(zhì)含量測定標準曲線白樣品處理據(jù)蛋白定量計算出的蛋白濃度，用 PBS 及上樣緩沖液進行配每個孔道中，相同的樣品體積均含有相同質(zhì)量的蛋白，本實其中含有 100μg 蛋白。配好的樣品置于金屬浴中，保證樣品在 100℃溫度下至少 10m性的目的，變性后的樣品即可進行后續(xù)實驗。S-PAGE 凝膠電泳玻璃板用洗滌劑吸凈，并用去離子水沖洗，置于玻璃板架上晾照“外高內(nèi)低”的原則，將玻璃板安裝在制膠架上，并用去裝置不漏后，再進行灌膠。據(jù)所跑蛋白樣品的分子量大小，配置不同濃度的分離膠；移液槍，將配置好的分離膠灌注到剛剛裝好的玻璃板的縫隙

中國醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文16圖 2.2 細胞質(zhì)譜標準曲線圖2.2.11.3 裸鼠移植瘤實驗（1）瘤體處理種瘤 13 天后，每隔一天腹腔注射 ADR(1.5mg/Kg)，于第 30 天取瘤，稱重，每個瘤取 0.2g，勻漿機破碎組織，反復(fù)凍融裂解細胞 3 次，用于樣品處理。（2）瘤標準曲線取空白瘤體約 0.6g，勻漿機破碎組織，反復(fù)凍融裂解 3 次，按重量平均分成 6 份

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本文編號：2735432