發(fā)布時(shí)間：2020-06-30 09:12

【摘要】：目的:從來源于植物內(nèi)生真菌Phomopsis的六種化合物中篩選出具有抗腫瘤活性的天然化合物Dicerandrol B,以人宮頸癌HeLa細(xì)胞為研究對(duì)象,從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激--線粒體損傷途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡角度探討Dicerandrol B抑制HeLa細(xì)胞增殖的作用機(jī)制,為開發(fā)新型天然抗腫瘤藥物提供理論依據(jù)。方法:1.MTT方法檢測來源于內(nèi)生真菌Phomopsis中六種化合物HX03、HX05、HX06、TPB3、HTT46和TPBR1在不同時(shí)間、不同劑量下對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞和人胃癌MGC803細(xì)胞的增殖抑制能力,并選取人乳腺上皮細(xì)胞MCF10A做為良性對(duì)照細(xì)胞,從六種化合物中篩選出最佳抗腫瘤活性的化合物HX06,即Dicerandrol B。2.PI單染法流式細(xì)胞儀檢測經(jīng)Dicerandrol B作用后的HeLa細(xì)胞的細(xì)胞周期分布。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測細(xì)胞周期相關(guān)基因MKi-67和泛素結(jié)合酶E2S(UBE2S)的基因水平,以確定Dicerandrol B是否影響HeLa細(xì)胞周期。3.Annexin V-FITC/PI染色法流式細(xì)胞儀檢測經(jīng)Dicerandrol B作用后的HeLa細(xì)胞發(fā)生凋亡的細(xì)胞百分比,用Western blot檢測與細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白質(zhì)cleaved-PARP的表達(dá)水平,驗(yàn)證Dicerandrol B是否引起HeLa細(xì)胞發(fā)生凋亡。4.Western Blot方法檢測Dicerandrol B作用后HeLa細(xì)胞中與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白質(zhì)Grp78和泛素化蛋白的表達(dá)水平,判斷Dicerandrol B誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡的原因是否通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。5.熒光染色方法用活性氧敏感熒光探針DCFH-DA并聯(lián)合應(yīng)用抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC),檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平。同時(shí),用MTT檢測細(xì)胞生存率,明確NAC聯(lián)合Dicerandrol B是否可以上調(diào)細(xì)胞生存率。6.Western Blot和實(shí)時(shí)定量PCR方法分析Dicerandrol B處理HeLa細(xì)胞6h細(xì)胞中p62蛋白,Keapl蛋白,細(xì)胞核Nrf2蛋白,p62基因,Nrf2基因,GPX1基因的變化以及Dicerandrol B處理HeLa細(xì)胞24h細(xì)胞核Nrf2蛋白,GPX1基因的改變,分析Dicerandrol B對(duì)HeLa細(xì)胞p62-Keapl-Nrf2信號(hào)通路的影響。7.Western Blot檢測與線粒體損傷相關(guān)蛋白質(zhì)Bcl-2、Bax、CytC的表達(dá)水平,判斷Bax/Bcl-2比率的變化,以確定Dicerandrol B是否通過線粒體損傷途徑誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡。結(jié)果:1.與其他五種化合物(HX03,HX05,TPB3,HTT46和TPBR1)相比,Dicerandrol B(HX06)具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性且對(duì)人良性乳腺上皮細(xì)胞增殖抑制能力較弱。用Dicerandrol B處理HeLa細(xì)胞24h,48h和96h,其ICso值分別為 7.13μg/mL,3.00μg/mL 和 1.84μg/mL,Dicerandrol B 抑制 HeLa 細(xì)胞的增殖呈現(xiàn)劑量依賴性和時(shí)間依賴性。2.流式結(jié)果顯示Dicerandrol B處理HeLa細(xì)胞24h與對(duì)照組相比,3μg/mL組G2/M期HeLa細(xì)胞數(shù)量增加67.24%,S期HeLa細(xì)胞數(shù)量下降17.91%;5μg/mL組G2/M期HeLa細(xì)胞數(shù)量增加71.27%,S期HeLa細(xì)胞數(shù)量下降29.08%。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示Dicerandrol B誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞中細(xì)胞周期相關(guān)基因MKi-67基因表達(dá)上調(diào),UBE2S基因表達(dá)降低。這些數(shù)據(jù)說明,HeLa細(xì)胞在Dicerandrol B的作用下發(fā)生了細(xì)胞周期G2/M期阻滯。3.流式結(jié)果顯示Dicerandrol B處理HeLa細(xì)胞24h,3μg/mL組凋亡細(xì)胞百分比為30.9%,5μg/mL組凋亡細(xì)胞百分比為45%,與對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)。同時(shí)Dicerandrol B引起HeLa細(xì)胞中cleaved-PARP的水平上調(diào),說明HeLa細(xì)胞在Dicerandrol B的作用下發(fā)生了細(xì)胞凋亡。4.Western Blot結(jié)果顯示,Dicerandrol B處理HeLa細(xì)胞12h,細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白Grp78和Ub的水平增加,這表明HeLa細(xì)胞在DicerandrolB作用下發(fā)生了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。5.Dicerandrol B處理HeLa細(xì)胞24h,與對(duì)照組相比,HeLa細(xì)胞中ROS水平明顯增加,聯(lián)合應(yīng)用NAC后,ROS水平降低。MTT結(jié)果顯示,Dicerandrol B聯(lián)合NAC后,細(xì)胞生存率較未應(yīng)用NAC提高,說明Dicerandrol B引起HeLa細(xì)胞產(chǎn)生ROS。6.Western Blot和實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示,Dicerandrol B處理HeLa細(xì)胞6h,HeLa細(xì)胞中p62和Keap1蛋白水平減低,細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白水平增加,Nrf2基因和GPX1基因表達(dá)增多,說明HeLa細(xì)胞在Dicerandrol B作用下為了對(duì)抗氧化應(yīng)激激活了 p62-Keap1-Nrf2信號(hào)通路,并引起下游抗氧化酶谷胱甘肽過氧化物酶GPX1基因的表達(dá)增高。Dicerandrol B處理HeLa細(xì)胞24h細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白水平減少,GPX1基因表達(dá)也下降,說明Dicerandrol B作用時(shí)間延長,p62-Keapl-Nrf2信號(hào)通路活化程度減弱。7.Western Blot 結(jié)果顯示,Dicerandrol B 處理 HeLa 細(xì)胞 24h 細(xì)胞中 Bax/Bcl-2比率顯著增加,細(xì)胞漿中細(xì)胞色素C蛋白水平上調(diào)。這表明HeLa細(xì)胞在Dicerandrol B作用下,線粒體損傷,細(xì)胞色素C釋放,Dicerandrol B誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞發(fā)生線粒體損傷途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。結(jié)論及創(chuàng)新點(diǎn):1.從內(nèi)生真菌Phomopsis代謝產(chǎn)物中篩選到具有較強(qiáng)抑制HeLa細(xì)胞增殖能力的 Dicerandrol B。2.明確了 Dicerandrol B抑制HeLa細(xì)胞增殖的機(jī)制,一方面是引起HeLa細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯G2/M期;另一方面是誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞發(fā)生了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激—線粒體損傷介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。3.明確了 Dicerandrol B作用下p62-Keapl-Nrf2信號(hào)通路的調(diào)節(jié)情況。本研究對(duì)Dicerandrol B抑制人宮頸癌HeLa增殖的機(jī)制進(jìn)行探討即本論文的創(chuàng)新所在。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R737.33
【圖文】：

處理人胃癌ＭＧＣ８０３細(xì)胞２４ｈ，引起人胃癌ＭＧＣ８０３細(xì)胞增殖率下降，這表明六逡逑種化合物均具有抑制ＨｅＬａ細(xì)胞和ＭＧＣ８０３細(xì)胞增殖的能力（／Ｋ０．０１）。不同濃逡逑度化合物作用下，ＨｅＬａ細(xì)胞的增殖率見圖４．１，胃癌ＭＧＣ８０３細(xì)胞的增殖率見逡逑圖邋４．２。逡逑Ａ邐Ｂ逡逑１２０邐＿＿—ＨＸ０３邋２４ｈ邐ｌｉ０邋＇邐—ＨＸ０５邋２４ｈ逡逑２邋１００邋１邐－邋■－邋ＨＸ０３邋９Ｇｈ邐２１００邋Ｊｊ邋ｉ邋－邋？－邋ＨＸ０５邋９６ｈ逡逑｜邐８０－邐｜邐８０邋■逡逑＆邐６０邋■邐Ｓ．邐６０邋■逡逑＝邐＼邋ｆ邐ｉ邋－逡逑Ｉ邋４０邋，邐、＼邐Ｉ邋４０邋．邐、、逡逑ｓ邋１０邋■邐＼邐３邋２０邋？逡逑０邐．邐ｕ邐＾邐？邐０邐■邐？邐ｉ邐ｉ邋邐邋ｉ邋１１邋ｉ逡逑0邋１邐２邐４邐８邐１６邐０１２４８邐１６逡逑ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（ｎｇ／ｍＬ）邐ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（ｎｇ／ｍｌ）逡逑Ｃ邐Ｄ逡逑１２０邋ｉ邐ＴＰＢ３邋２４ｈ邐１２０邐—？—ＨＴＴ４Ｇ邋２４ｈ逡逑■0邋ｉ00邋，邐一邋＊－邋ＴＰＢ３邋９６ｈ邐２邋ｌ00邋？邋＾＾邋＾＿邐一邋卜邋ＨＴＴ４６邋９６ｈ逡逑Ｉ－邐卜逡逑１邋４０邋■邐＇ＳＮ邐ｉ邋４０．逡逑

ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（｜ｉｇ／ｍＬ）邐ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（ｐｇ／ｍＬ）逡逑圖４．１邋ＭＴＴ法檢測六種化合物對(duì)ＨｅＬａ細(xì)胞增殖的抑制（２４ｈ和９６ｈ）逡逑Ｆｉｇ．４．１邋Ｔｈｅ邋ｃｅｌｌ邋ｖｉａｂｉｌｉｔｙ邋ｏｆ邋ＨＸ０３，邋ＨＸ０５，邋ＨＸ０６，邋ＴＰＢ３，邋ＨＴＴ４６邋ａｎｄ邋ＴＰＢＲ１邋ｏｎ逡逑ｈｕｍａｎ邋ｃｅｒｖｉｃａｌ邋ｃａｎｃｅｒ邋ＨｅＬａ邋ｃｅｌｌ：邋（Ａ）ＨＸ０３，邋（Ｂ）ＨＸ０５，邋（Ｃ）ＴＰＢ３，邋（Ｄ）ＨＴＴ４６，逡逑（Ｅ）ＴＰＢＲｌ，邋（Ｆ）ＨＸ０６．逡逑｜逡逑４２逡逑

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本文編號(hào)：2735146