【摘要】：目的:探討孕激素(Progesterone,P)及磷脂酰肌醇-3-激酶(Phosphoinositide 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(Protein kinase B,PKB/AKT)抑制劑LY294002單獨及聯(lián)合干預(yù)下調(diào)節(jié)FOXO1表達(dá)對不同孕激素受體(Progesterone receptor,PR)卵巢癌細(xì)胞增殖、凋亡的作用機(jī)制,為卵巢癌激素治療及靶向治療提供理論依據(jù)。方法:選取生長良好的卵巢癌細(xì)胞株HO-8910(PR高表達(dá))、SKOV3(PR低表達(dá))作為研究對象。1.CCK-8法分別檢測不同濃度P(0、12.5、25、50、100μmol/L)及LY(0、5、10、20、40μmol/L)單獨作用24h、48h、72h對兩株細(xì)胞的增殖影響。2.取生長良好的兩株細(xì)胞均分4組:對照組(0μmol/L)、實驗組:P組(25μmol/L)、P+LY組(25+20μmol/L)、LY組(20μmol/L),對照組加入等量不含藥物的培養(yǎng)液。干預(yù)24h行相關(guān)實驗檢測:(1)CCK-8法檢測兩株細(xì)胞的增殖情況;(2)倒置顯微鏡觀察兩株細(xì)胞生長形態(tài)改變;(3)Annexin V-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測兩株細(xì)胞的凋亡情況;(4)免疫印跡法(Western Blot)檢測各組中p-AKTSer473、p-FOXO1Ser256、FOXO1、PR-A、PR-B蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果:1.CCK-8檢測兩株細(xì)胞增殖情況:(1)不同濃度P作用:除外12.5μmol/L的P作用24h,與對照組SKOV3細(xì)胞存活率相比無明顯差異(P0.05),其余各實驗組與對照組及各實驗組間細(xì)胞存活率相比均有差異(P0.05)。12.5-100μmol/L的P對HO-8910細(xì)胞抑制增殖作用顯著高于SKOV3細(xì)胞且細(xì)胞存活率呈劑量-效應(yīng)與時間-效應(yīng)依賴性降低。(2)不同濃度LY干預(yù):除外5μmol/L的LY作用24h、48h對兩株細(xì)胞抑制增殖能力無明顯差異(P0.05),其余各實驗組與對照組及各實驗組間細(xì)胞存活率相比均有差異(P0.05)。5-40μmol/L的LY對HO-8910、SKOV3細(xì)胞抑制增殖作用相似且細(xì)胞存活率呈劑量-效應(yīng)與時間-效應(yīng)依賴性下降。(3)P(25μmol/L)及LY(20μmol/L)聯(lián)合作用24h,HO-8910、SKOV3細(xì)胞存活率分別為45.95±1.70%、72.23±2.08%。與藥物單獨作用相比,均為P+LY組抑制增殖效果最顯著(P0.05),且對HO-8910細(xì)胞抑制增殖作用較SKOV3細(xì)胞明顯。2.倒置顯微鏡觀察兩株細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變:對照組HO-8910、SKOV3呈上皮樣細(xì)胞生長,類圓形、梭形、鋪路石樣排列緊湊貼壁生長,細(xì)胞邊界清晰。實驗組HO-8910細(xì)胞間隙增大并可見細(xì)胞碎片,細(xì)胞粘附性變差,貼壁細(xì)胞減少,懸浮細(xì)胞增多,細(xì)胞呈長梭形不規(guī)則改變,且鏡下P+LY組形態(tài)變化最顯著;SKOV3細(xì)胞P組形態(tài)變化不顯著,P+LY組與LY組細(xì)胞間隙增大,部分細(xì)胞呈多角形,界限不清有融合現(xiàn)象,未見明顯漂浮細(xì)胞。3.兩株細(xì)胞凋亡情況:(1)與對照組相比,各實驗組凋亡率均增加(P0.05);(2)與藥物的單獨作用相比,均為P+LY組凋亡率最高(P0.05);(3)P組及P+LY組對HO-8910促凋亡作用較SKOV3顯著增高,兩者凋亡率相比(P0.05);(4)LY組對兩株細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡作用相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。4.兩株細(xì)胞Western Blot結(jié)果顯示:(1)與對照組相比,各實驗組p-AKTSer473、p-FOXO1Ser256表達(dá)降低,FOXO1表達(dá)增加,且均為P+LY組p-AKTSer473、p-FOXO1Ser256降低最顯著,FOXO1增加最明顯;(2)P組及P+LY組作用下,對HO-8910降低p-AKTSer473、p-FOXO1Ser256,上調(diào)FOXO1能力較SKOV3顯著,兩者蛋白表達(dá)相比(P0.05);(3)而LY組一定時間及濃度下,對兩細(xì)胞株p-AKTSer473、p-FOXO1Ser256、FOXO1表達(dá)無顯著差異(P0.05);(4)雖然藥物干預(yù)后與對照組PR-B、PR-A表達(dá)相比無明顯差異(P0.05),但兩細(xì)胞株間PR-B、PR-A表達(dá)相比(P0.05),對兩細(xì)胞株P(guān)R-B/PR-A比值進(jìn)一步分析,顯示HO-8910細(xì)胞PR-B在PR中所占比例較SKOV3細(xì)胞增加顯著(P0.05)。結(jié)論:1.孕激素可能主要通過PR-B介導(dǎo)下調(diào)PI3K/AKT活性,促進(jìn)FOXO1的表達(dá),從而影響HO-8910、SKOV3卵巢癌細(xì)胞的增殖、凋亡。2.LY294002對抑制PI3K/AKT活化,其上調(diào)FOXO1的作用機(jī)制可能與PR表達(dá)水平無關(guān)。3.孕激素及LY294002聯(lián)合應(yīng)用對卵巢癌HO-8910、SKOV3細(xì)胞抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡具有協(xié)同作用。
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R737.31
【圖文】：

與對照組相比，細(xì)胞活性顯著降低且細(xì)胞增殖活性呈時間-效應(yīng)、劑量-效應(yīng)依賴性降低關(guān)系。（見表 1，圖1）對于 SKOV3 細(xì)胞，12.5μmol/L 的 P 作用 24h 后，與對照組細(xì)胞存活率相比，差異不明顯（P>0.05），隨著作用時間 48h、72h 延長，與對照組細(xì)胞存活率相比（P<0.05）。其余各組細(xì)胞存活率比較均有顯著差異，增殖活性具有時間-效應(yīng)與劑量-效應(yīng)依賴性降低趨勢。（見表 2，圖 2）一定時間及濃度作用下，P 對 HO-8910 細(xì)胞抑制增殖作用顯著強(qiáng)于 SKOV3 細(xì)胞。我們將采用 25μmol/L 的 P 作用時間為 24h 用于后續(xù)實驗研究。表 1 不同濃度的 P 作用 24 h、48 h、72 h 后 HO-8910 細(xì)胞的存活率（ x ±s

圖 2 不同濃度 P 作用 24 h、48 h、72 h 后 SKOV3 細(xì)胞存活率曲線3.12 CCK-8 檢測不同濃度 LY 對 HO-8910、SKOV3 細(xì)胞增殖活性的影響對于 HO-8910、SKOV3 細(xì)胞，LY 干預(yù)下各實驗組細(xì)胞存活率與未給藥組相比，細(xì)胞增殖活性均受到抑制（P<0.05）；相同濃度 LY 分別作用 24h、48h、72h 的各時間段實驗組存活率比較，除外 5μmol/L 的 LY 作用 24h、48h 對兩株細(xì)胞抑制增殖能力無明顯差異（P>0.05），其余各組均有顯著差異；相同時間以不同濃度 LY 作用后各濃度組存活率比較（P<0.05）。當(dāng) LY 在 5-40μmol/L 干預(yù)下，對兩株細(xì)胞增殖活性具有劑量-效應(yīng)與時間-效應(yīng)依賴性降低關(guān)系。（見表 3-4，圖 3-4）但總體來說，不同濃度 LY 干預(yù)下對 HO-8910、SKOV3 細(xì)胞抑制增殖作用相似。我們將采用 20μmol/L 的 LY 作用時間為 24h 用于后續(xù)實驗研究。

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1 陸曉e

本文編號：2727744