【摘要】：卵巢癌的分子機(jī)制很繁鎖,研究表明mi RNA是關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。本研究旨在探討卵巢惡性腫瘤發(fā)展中mi R-629的主要作用,揭示其可能的分子機(jī)制。睪丸特異性Y樣蛋白5(TSPYL5)是各種癌癥中的腫瘤抑制基因,但其在卵巢癌中的作用研究很少。本研究分三部分。第一部分卵巢癌中mi R-629和TSPYL5的作用研究目的:探討卵巢癌組織中mi R-629及TSPYL5的差異表達(dá)及mi R-629對(duì)卵巢癌細(xì)胞的影響。方法:1.利用RT-PCR檢測(cè)腫瘤及鄰近組織中mi RNA的水平,再用RT-PCR、Western-blot檢測(cè)TSPYL5的表達(dá),選mi R-629及TSPYL5為目的基因,同時(shí)免疫組化、HE染色研究卵巢癌組織的病理特征。2.合成mi R-629-inhibitor和mi R-629-mimics,分別轉(zhuǎn)染OVCAR3細(xì)胞抑制或增強(qiáng)mi R-629的功能作為實(shí)驗(yàn)組,mock組作為對(duì)照。流式細(xì)胞術(shù)、Transwell、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)等進(jìn)行細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)。結(jié)果:1.病理結(jié)果表明卵巢癌組織中有大量的大細(xì)胞核,caspase3表達(dá)明顯受抑制。相對(duì)于癌旁組織mi R-629在卵巢癌中高表達(dá),而TSPYL5表達(dá)減少或缺失(P0.05)。2.流式實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)mi R-629顯著降低OVCAR3細(xì)胞凋亡率,并且在mimics組和mock組中有顯著差異。細(xì)胞周期測(cè)定進(jìn)一步證實(shí)mi R-629對(duì)細(xì)胞凋亡和增殖的抑制作用。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與mock組細(xì)胞相比,過(guò)表達(dá)mi R-629有效地促進(jìn)了細(xì)胞遷移,其中mi R-629-inhibitor組具有最廣泛的細(xì)胞劃痕。Transwell結(jié)果表明mi R-629的過(guò)表達(dá)明顯促進(jìn)OVCAR3細(xì)胞的侵襲,mimics組和mock組有顯著差異(P0.05)。結(jié)論:mi R-629促進(jìn)OC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。TSPYL5在OC組織和細(xì)胞系中均起抑制腫瘤的作用。第二部分Mi R-629通過(guò)靶向調(diào)控TSPYL5抑制卵巢癌惡性行為體外機(jī)制研究目的:探討mi R-629在卵巢癌進(jìn)展中的關(guān)鍵作用,揭示其作用可能的分子機(jī)制。方法:1.合成pc DNA3.1-TSPYL5轉(zhuǎn)染OVCAR3細(xì)胞,同時(shí)合成TSPYL5-空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染OVCAR3作為對(duì)照組,利用Transwell、流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞功能。2.mi RWALK預(yù)測(cè)TSPYL5為mi R-629的潛在靶標(biāo)。截取TSPYL5 3'UTR序列,構(gòu)建psi-CHECK2野生型和突變型載體,同時(shí)轉(zhuǎn)染mi R-629,雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證mi R-629與TSPYL5的關(guān)系。3.OVCAR3細(xì)胞分別被轉(zhuǎn)染mi R-629-inhibitor、和mi R-629-inhibitor-si TSPYL5a作為實(shí)驗(yàn)組,black組和NC組作為對(duì)照組。Transwell、劃痕、流式分別檢測(cè)各組細(xì)胞的侵襲、遷移、增殖、凋亡等功能。結(jié)果:1.細(xì)胞功能結(jié)果顯示,TSPYL5過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)OVCAR3細(xì)胞凋亡(P=0.022);TSPYL5能抑制細(xì)胞增殖,縮短細(xì)胞周期的S期,提高G0/G1比值(P=0.022);TSPYL5也抑制了細(xì)胞的遷移和侵襲,與NC相比,細(xì)胞凋亡率顯著增加(P0.01),遷移和侵襲能力降低(P0.01)。2.來(lái)自mi RWALK潛在靶點(diǎn)中TSPYL5和mi R-629結(jié)合可能性比較大,雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)報(bào)告證明,mi R-629抑制野生型TSPYL5 3'UTR的熒光素酶活性,但在突變型TSPYL5 3'UTR中阻止這種抑制。3.細(xì)胞功能結(jié)果顯示,用mi R-629抑制劑轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,細(xì)胞凋亡減少,G0/G1期增強(qiáng),細(xì)胞遷移率增加,而和TSPYL5-si RNA共轉(zhuǎn)染組顯著阻斷細(xì)胞凋亡、遷移和侵襲。而空白組中OVCAR3細(xì)胞具有最活躍的遷移和侵襲能力。結(jié)論:TSPYL5在卵巢癌中起腫瘤抑制作用。mi R-629通過(guò)直接結(jié)合TSPYL5的3'UTR來(lái)抑制OC細(xì)胞中TSPYL5的表達(dá),促進(jìn)了卵巢癌的發(fā)展。相反,干預(yù)mi R-629的表達(dá),可抑制卵巢癌的惡性行為。第三部分mi R-629抑制裸鼠卵巢移植瘤生長(zhǎng)機(jī)制研究目的:mi R-629對(duì)卵巢腫瘤生長(zhǎng)體內(nèi)影響的機(jī)制研究。方法:首先采用mi R-629 inhibitor慢病毒感染OVCAR3,獲取穩(wěn)定干擾的腫瘤細(xì)胞,再注射到裸鼠皮下成瘤,并定期測(cè)量瘤體體積;30天后處死裸鼠,剝離瘤體,用RT-PCR和Western-blot分別檢測(cè)瘤體中mi R-629和TSPYL5的表達(dá)水平;同時(shí),采用HE染色檢測(cè)瘤體病理情況,免疫組化檢測(cè)TSPYL5的表達(dá)情況。結(jié)果:瘤體的體積在移植瘤后15天時(shí)出現(xiàn)差異,隨著繼續(xù)飼養(yǎng),差異進(jìn)一步拉大;在第30天時(shí),inhibitor組瘤體顯著小于空白組和對(duì)照組。RT-PCR結(jié)果表明,mi R-629在inhibitor組瘤體中的表達(dá)顯著低于空白組和對(duì)照組,而TSPYL5的表達(dá)則相反,進(jìn)一步Western-blot結(jié)果顯示,TSPYL5在inhibitor中表達(dá)較高。同時(shí),免疫組化結(jié)果,與空白組和對(duì)照組相比,TSPYL5在inhibitor組中表達(dá)更高;且瘤體出現(xiàn)組織壞死的情況。結(jié)論:研究進(jìn)一步在體內(nèi)驗(yàn)證了干預(yù)mi R-629的表達(dá),能夠上調(diào)TSPYL5的表達(dá)水平,同時(shí)對(duì)卵巢腫瘤的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R737.31
【圖文】：

所有 RT-PCR 使用 ABI Prism 7500 系統(tǒng)進(jìn)行。為每個(gè)樣品設(shè)計(jì)復(fù)孔，平均值作為測(cè)試結(jié)果。最小化逆轉(zhuǎn)錄中 RT-PCR 反應(yīng)和樣品之間的管家基因 U6 用作內(nèi)參及 GAPDH 來(lái)樣品標(biāo)準(zhǔn)化。樣品相對(duì)于參照樣品的倍 2-ΔΔCt。結(jié)果表明，管家基因和樣品靶基因均通過(guò) RT-PCR 擴(kuò)增并通過(guò)瓊脂泳檢測(cè)，單 條帶，RT-PCR 反應(yīng)特異性好（圖 1），具有良好的擴(kuò)增曲線(xiàn)線(xiàn)（圖 2），說(shuō)明我們所設(shè)計(jì)的引物具有特異性并且反應(yīng)體系穩(wěn)定。RT-P現(xiàn)，與卵巢癌癌旁組織相比，卵巢癌組織中 miR-449b-3p，miR-483-5P，miR922 低表達(dá)，而 miR-23-5p， miR-150-3p， miR-505，miR-30-3P，miR-6510-3P 高表達(dá)，其中 miR-629 在癌組織和癌旁組織中比較，其差異最大，取 miR-629 作為目的 miRNA（圖 3）。目標(biāo) miRNA、 GAPDH、TSPYL5設(shè)計(jì)（表 1）。

溶解擴(kuò)增圖

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2723063