【摘要】：卵巢癌的分子機制很繁鎖,研究表明mi RNA是關鍵調節(jié)因子。本研究旨在探討卵巢惡性腫瘤發(fā)展中mi R-629的主要作用,揭示其可能的分子機制。睪丸特異性Y樣蛋白5(TSPYL5)是各種癌癥中的腫瘤抑制基因,但其在卵巢癌中的作用研究很少。本研究分三部分。第一部分卵巢癌中mi R-629和TSPYL5的作用研究目的:探討卵巢癌組織中mi R-629及TSPYL5的差異表達及mi R-629對卵巢癌細胞的影響。方法:1.利用RT-PCR檢測腫瘤及鄰近組織中mi RNA的水平,再用RT-PCR、Western-blot檢測TSPYL5的表達,選mi R-629及TSPYL5為目的基因,同時免疫組化、HE染色研究卵巢癌組織的病理特征。2.合成mi R-629-inhibitor和mi R-629-mimics,分別轉染OVCAR3細胞抑制或增強mi R-629的功能作為實驗組,mock組作為對照。流式細胞術、Transwell、細胞劃痕實驗等進行細胞功能實驗。結果:1.病理結果表明卵巢癌組織中有大量的大細胞核,caspase3表達明顯受抑制。相對于癌旁組織mi R-629在卵巢癌中高表達,而TSPYL5表達減少或缺失(P0.05)。2.流式實驗結果顯示,過表達mi R-629顯著降低OVCAR3細胞凋亡率,并且在mimics組和mock組中有顯著差異。細胞周期測定進一步證實mi R-629對細胞凋亡和增殖的抑制作用。細胞劃痕實驗結果表明,與mock組細胞相比,過表達mi R-629有效地促進了細胞遷移,其中mi R-629-inhibitor組具有最廣泛的細胞劃痕。Transwell結果表明mi R-629的過表達明顯促進OVCAR3細胞的侵襲,mimics組和mock組有顯著差異(P0.05)。結論:mi R-629促進OC細胞增殖、遷移和侵襲。TSPYL5在OC組織和細胞系中均起抑制腫瘤的作用。第二部分Mi R-629通過靶向調控TSPYL5抑制卵巢癌惡性行為體外機制研究目的:探討mi R-629在卵巢癌進展中的關鍵作用,揭示其作用可能的分子機制。方法:1.合成pc DNA3.1-TSPYL5轉染OVCAR3細胞,同時合成TSPYL5-空載質粒轉染OVCAR3作為對照組,利用Transwell、流式細胞術、細胞劃痕實驗檢測細胞功能。2.mi RWALK預測TSPYL5為mi R-629的潛在靶標。截取TSPYL5 3'UTR序列,構建psi-CHECK2野生型和突變型載體,同時轉染mi R-629,雙熒光素酶實驗驗證mi R-629與TSPYL5的關系。3.OVCAR3細胞分別被轉染mi R-629-inhibitor、和mi R-629-inhibitor-si TSPYL5a作為實驗組,black組和NC組作為對照組。Transwell、劃痕、流式分別檢測各組細胞的侵襲、遷移、增殖、凋亡等功能。結果:1.細胞功能結果顯示,TSPYL5過表達可以促進OVCAR3細胞凋亡(P=0.022);TSPYL5能抑制細胞增殖,縮短細胞周期的S期,提高G0/G1比值(P=0.022);TSPYL5也抑制了細胞的遷移和侵襲,與NC相比,細胞凋亡率顯著增加(P0.01),遷移和侵襲能力降低(P0.01)。2.來自mi RWALK潛在靶點中TSPYL5和mi R-629結合可能性比較大,雙熒光素酶實驗報告證明,mi R-629抑制野生型TSPYL5 3'UTR的熒光素酶活性,但在突變型TSPYL5 3'UTR中阻止這種抑制。3.細胞功能結果顯示,用mi R-629抑制劑轉染細胞后,細胞凋亡減少,G0/G1期增強,細胞遷移率增加,而和TSPYL5-si RNA共轉染組顯著阻斷細胞凋亡、遷移和侵襲。而空白組中OVCAR3細胞具有最活躍的遷移和侵襲能力。結論:TSPYL5在卵巢癌中起腫瘤抑制作用。mi R-629通過直接結合TSPYL5的3'UTR來抑制OC細胞中TSPYL5的表達,促進了卵巢癌的發(fā)展。相反,干預mi R-629的表達,可抑制卵巢癌的惡性行為。第三部分mi R-629抑制裸鼠卵巢移植瘤生長機制研究目的:mi R-629對卵巢腫瘤生長體內影響的機制研究。方法:首先采用mi R-629 inhibitor慢病毒感染OVCAR3,獲取穩(wěn)定干擾的腫瘤細胞,再注射到裸鼠皮下成瘤,并定期測量瘤體體積;30天后處死裸鼠,剝離瘤體,用RT-PCR和Western-blot分別檢測瘤體中mi R-629和TSPYL5的表達水平;同時,采用HE染色檢測瘤體病理情況,免疫組化檢測TSPYL5的表達情況。結果:瘤體的體積在移植瘤后15天時出現(xiàn)差異,隨著繼續(xù)飼養(yǎng),差異進一步拉大;在第30天時,inhibitor組瘤體顯著小于空白組和對照組。RT-PCR結果表明,mi R-629在inhibitor組瘤體中的表達顯著低于空白組和對照組,而TSPYL5的表達則相反,進一步Western-blot結果顯示,TSPYL5在inhibitor中表達較高。同時,免疫組化結果,與空白組和對照組相比,TSPYL5在inhibitor組中表達更高;且瘤體出現(xiàn)組織壞死的情況。結論:研究進一步在體內驗證了干預mi R-629的表達,能夠上調TSPYL5的表達水平,同時對卵巢腫瘤的生長產(chǎn)生抑制作用。
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R737.31
【圖文】：

所有 RT-PCR 使用 ABI Prism 7500 系統(tǒng)進行。為每個樣品設計復孔，平均值作為測試結果。最小化逆轉錄中 RT-PCR 反應和樣品之間的管家基因 U6 用作內參及 GAPDH 來樣品標準化。樣品相對于參照樣品的倍 2-ΔΔCt。結果表明，管家基因和樣品靶基因均通過 RT-PCR 擴增并通過瓊脂泳檢測，單 條帶，RT-PCR 反應特異性好（圖 1），具有良好的擴增曲線線（圖 2），說明我們所設計的引物具有特異性并且反應體系穩(wěn)定。RT-P現(xiàn)，與卵巢癌癌旁組織相比，卵巢癌組織中 miR-449b-3p，miR-483-5P，miR922 低表達，而 miR-23-5p， miR-150-3p， miR-505，miR-30-3P，miR-6510-3P 高表達，其中 miR-629 在癌組織和癌旁組織中比較，其差異最大，取 miR-629 作為目的 miRNA（圖 3）。目標 miRNA、 GAPDH、TSPYL5設計（表 1）。

溶解擴增圖

【參考文獻】

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本文編號：2723063