【摘要】：目的:子宮內(nèi)膜異位癥(Endometriosis,EMS,內(nèi)異癥)在婦科領(lǐng)域是一種依賴于雌激素的慢性常見病,自身細胞功能障礙可能是該病病因。其典型的臨床表現(xiàn)為盆腔腫塊和痛經(jīng),可引起慢性盆腔疼痛,不孕等疾病,并具有廣泛植入和惡性腫瘤侵襲性生長能力等生物學(xué)行為。關(guān)于EMS的文獻提示在位內(nèi)膜自身的分子生物學(xué)特性與正常子宮內(nèi)膜有很大區(qū)別,例如遷徙、侵襲、增殖、凋亡和血管生成能力等,這些現(xiàn)象可能是基因水平的表達差異引起的,而且在子宮內(nèi)膜處于分泌期時,相應(yīng)生物學(xué)功能更強。最近的研究發(fā)現(xiàn),在位內(nèi)膜的細胞周期相關(guān)基因的異常表達同樣會引起內(nèi)異癥。本課題組前期通過對內(nèi)異癥在位內(nèi)膜和正常子宮內(nèi)膜的長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA、lncRNA)芯片篩查結(jié)合生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)其中AC002454.1基因是差異表達的基因之一。AC002454.1是一種天然反義lncRNA。反義lncRNA起作用的經(jīng)典模式是與相鄰基因的mRNA形成RNA-RNA二聚體,改善相鄰基因的mRNA的穩(wěn)定性,從而上調(diào)相鄰基因的表達。根據(jù)與正義鏈編碼基因重疊方向和長度,又將反義lncRNA的作用形式分為頭對頭、尾對尾和完全重疊。在芯片分析中,AC002454.1與其相鄰的周期蛋白依賴性激酶-6(Cyclin-dependent kinase 6,CDK6)基因相關(guān),兩者均位于7號染色體,有長約139個核苷酸的重疊區(qū)。AC002454.1與CDK6以頭對頭重疊的形式存在,即反義鏈5’端序列與正義鏈的5’端序列互補。并且已經(jīng)通過實時熒光定量PCR(Quantitative real-time polymerase chain reaction、qRT-PCR)實驗驗證,內(nèi)異癥患者在位內(nèi)膜中AC002454.1 mRNA相對表達量明顯增高并且與CDK6 mRNA正相關(guān)。CDK6是細胞周期調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用的蛋白激酶,在細胞G1期中結(jié)合CyclinD1,磷酸化下游pRb,釋放結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子E2F,使細胞周期的進程得以啟動,同時啟動細胞增殖相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。芯片分析中CDK6是在pathway分析排在首位的細胞周期通路中差異倍數(shù)最高的mRNA,GO分析也提示差異mRNA轉(zhuǎn)錄本主要與細胞周期有關(guān)。CDK6除了作為激酶的活性功能外,可以增強血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGF-A)表達水平,促進血管生成及內(nèi)皮細胞生長。CDK6的作用機制與內(nèi)異癥形成過程相吻合,即在位內(nèi)膜細胞隨經(jīng)血逆流后進入盆腔后需黏附在異位部位、進而通過血管生成,細胞侵襲等過程,種植于異位部位。因此得出推測:CDK6功能異�？梢鹱訉m內(nèi)膜細胞細胞周期紊亂,逃逸免疫清除,細胞生物學(xué)特性增強,而AC002454.1在內(nèi)異癥中的作用可能通過對CDK6的調(diào)節(jié)來實現(xiàn),共同參與內(nèi)異癥的發(fā)病過程。本研究擬利用組織實驗、體外細胞實驗探討AC002454.1和CDK6在內(nèi)異癥發(fā)病中的作用及機制,為內(nèi)異癥的發(fā)病機制研究提供理論基礎(chǔ)。研究方法:采用qRT-PCR檢測內(nèi)異癥在位內(nèi)膜組織和異位內(nèi)膜組織及正常子宮內(nèi)膜組織中AC002454.1和CDK6 mRNA的表達情況并進行相關(guān)性分析。利用蛋白免疫印跡方法(Western blot)和免疫組化方法檢測正常子宮內(nèi)膜組織,內(nèi)異癥在位內(nèi)膜組織和異位內(nèi)膜組織中CDK6蛋白的表達情況。借助于原代細胞培養(yǎng)技術(shù)、qRT-PCR、Western blot技術(shù)對內(nèi)異癥患者在位內(nèi)膜間質(zhì)細胞和正常子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞中AC002454.1和CDK6的表達量進行檢測。分別下調(diào)內(nèi)異癥患者在位內(nèi)膜間質(zhì)細胞中AC002454.1和CDK6表達量,分別上調(diào)正常子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞中AC002454.1和CDK6表達量,qRT-PCR和Western blot檢測慢病毒轉(zhuǎn)染前后AC002454.1和CDK6 mRNA和蛋白表達水平的改變,以及細胞周期相關(guān)蛋白pRb、cyclinD1、E2F的改變。CCK-8細胞增殖實驗檢測AC002454.1和CDK6表達變化的前后細胞增殖能力的改變。劃痕實驗對AC002454.1和CDK6表達變化前后細胞遷移能力進行檢測,Transwell細胞侵襲實驗對AC002454.1和CDK6表達變化前后細胞侵襲能力進行檢測,流式細胞技術(shù)對AC002454.1和CDK6表達變化前后細胞周期分布進行檢測。利用RNA純化染色質(zhì)分離實驗和蛋白質(zhì)譜分析檢測與AC002454.1特異性相互作用的蛋白。利用qRT-PCR對AC002454.1特異性相互作用的蛋白在內(nèi)異癥在位內(nèi)膜間質(zhì)細胞中的mRNA表達水平進行驗證,并分析與AC002454.1和CDK6表達的相關(guān)性。結(jié)果:1、qRT-PCR結(jié)果提示:AC002454.1和CDK6 mRNA相對表達量在內(nèi)異癥患者異位及在位內(nèi)膜組織中明顯高于正常內(nèi)膜組織(P0.05),而異位內(nèi)膜組織和在位內(nèi)膜組織之間表達量沒有顯著差異(P0.05)。在位內(nèi)膜組織與正常內(nèi)膜組織中AC002454.1和CDK6 mRNA相對表達量呈正相關(guān)(Pearson相關(guān)系數(shù)為:0.691,P0.001)。Western blot結(jié)果提示:內(nèi)異癥患者在位內(nèi)膜組織中CDK6蛋白相對表達量明顯高于正常內(nèi)膜組織(P0.05),而異位內(nèi)膜組織和在位內(nèi)膜組織之間表達差異不顯著(P0.05)。免疫組化結(jié)果提示:CDK6蛋白主要表達在子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞的細胞質(zhì)及細胞核中。CDK6蛋白在正常內(nèi)膜組織中表達的陽性率為15.0%,在內(nèi)異癥患者在位和異位內(nèi)膜組織中CDK6蛋白陽性率為82.0%和68%,以上結(jié)果提示,CDK6蛋白在內(nèi)異癥在位內(nèi)膜組織中表達陽性率明顯高于正常子宮內(nèi)膜組織(P0.05),而內(nèi)異癥異位內(nèi)膜組織和在位內(nèi)膜組織之間表達無顯著差異(P0.05)。2、體外細胞實驗中,qRT-PCR提示:與每組相對應(yīng)的空白對照組和陰性對照組結(jié)果相比,內(nèi)異癥在位內(nèi)膜間質(zhì)細胞下調(diào)AC002454.1表達量后AC002454.1表達明顯降低(P0.05),上調(diào)AC002454.1毒的正常子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞中AC002454.1表達明顯升高(P0.05),下調(diào)CDK6表達后,內(nèi)異癥在位內(nèi)膜間質(zhì)細胞中CDK6表達水平明顯降低(P0.05),上調(diào)CDK6表達后,正常子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞中CDK6表達水平明顯升高(P0.05),說明轉(zhuǎn)染成功。沉默AC002454.1組內(nèi)異癥在位內(nèi)膜間質(zhì)細胞中CDK6 mRNA表達量下降(P0.05),過表達AC002454.1組正常子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞中CDK6 mRNA表達量增高(P0.05)。Western blot結(jié)果提示:AC002454.1下調(diào)組內(nèi)異癥在位內(nèi)膜間質(zhì)細胞中CDK6蛋白表達量下降(P0.01),pRb、cyclinD1、E2F蛋白表達量下降(P0.05)。AC002454.1上調(diào)組正常子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞中CDK6蛋白表達量增高(P0.05),pRb、cyclinD1、E2F蛋白表達量上升(P0.05)。CCK8實驗檢測結(jié)果提示:內(nèi)異癥在位內(nèi)膜間質(zhì)細胞在沉默AC002454.1后增殖能力明顯降低(P0.05),沉默CDK6后增殖能力明顯降低(P0.05),正常內(nèi)膜間質(zhì)細胞在上調(diào)AC002454.1后增殖能力顯著增高(P0.05),過表達CDK6后增殖能力明顯增高(P0.05)。劃痕實驗檢測結(jié)果提示:內(nèi)異癥在位內(nèi)膜間質(zhì)細胞在下調(diào)AC002454.1后遷移能力明顯降低(P0.01),沉默CDK6后遷移能力明顯降低(P0.01),正常內(nèi)膜間質(zhì)細胞在上調(diào)AC002454.1后遷移能力增高(P0.01),過表達CDK6后遷移能力明顯增高(P0.01)。Transwell侵襲實驗結(jié)果提示:內(nèi)異癥在位內(nèi)膜間質(zhì)細胞沉默AC002454.1后侵襲能力明顯降低(P0.01),沉默CDK6后侵襲能力明顯降低(P0.01),正常子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞過表達AC002454.1后侵襲能力明顯增高(P0.01),過表達CDK6后侵襲能力明顯增高(P0.01)。流式細胞技術(shù)檢測結(jié)果提示:內(nèi)異癥在位內(nèi)膜間質(zhì)細胞沉默AC002454.1后細胞G0/G1期比例明顯增加,S期比例明顯減少(P0.01),沉默CDK6后細胞G0/G1期比例明顯增加,S期比例明顯減少(P0.01),正常子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞過表達AC002454.1后細胞G0/G1期比例明顯減少,S期比例明顯增加(P0.01),過表達CDK6后細胞G0/G1期比例明顯減少,S期比例明顯增加(P0.01)。3、RNA純化染色質(zhì)分離技術(shù)聯(lián)合蛋白質(zhì)譜分析檢測結(jié)果提示:與AC002454.1特異性相互作用的蛋白共有37個。STRING數(shù)據(jù)庫分析提示:其中熱休克蛋白90AB1(heat shock protein 90 k Da alpha,class B member 1,HSP90AB1)和CDK6存在蛋白相互作用關(guān)系,預(yù)測分數(shù)為0.472,在其他物種中相互作用分數(shù)為0.668。HitPredict數(shù)據(jù)庫提示二者相互作用分數(shù)為0.665。qRT-PCR提示:HSP90AB1 mRNA在內(nèi)異癥在位內(nèi)膜間質(zhì)細胞中表達高于正常子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞(P0.05),并且HSP90AB1 mRNA表達量與AC002454.1、CDK6 mRNA表達量呈正相關(guān)(Pearson相關(guān)系數(shù)分別為0.980和0.895、P0.01)。結(jié)論:1、AC002454.1和CDK6在內(nèi)異癥在位內(nèi)膜中均高表達,并呈正相關(guān),兩者均有促進在位內(nèi)膜間質(zhì)細胞增殖、遷移、侵襲的能力。AC002454.1和CDK6可能通過影響在位內(nèi)膜細胞生物學(xué)特性參與內(nèi)異癥的疾病發(fā)展。2、在在位內(nèi)膜間質(zhì)細胞中調(diào)節(jié)AC002454.1的表達后,CDK6 mRNA及蛋白表達相應(yīng)發(fā)生變化,細胞周期相關(guān)蛋白pRb、cyclinD1、E2F隨之變化,細胞G0/G1期和S期比例發(fā)生改變。AC002454.1調(diào)節(jié)CDK6的表達可能是內(nèi)異癥在位內(nèi)膜細胞周期紊亂等分子生物學(xué)異常的分子機制。3、AC002454.1特異性相互作用的蛋白HSP90AB1,與CDK6蛋白之間也存在蛋白互作關(guān)系并且在內(nèi)異癥在位內(nèi)膜細胞中表達相關(guān)。說明AC002454.1可能通過HSP90AB1作為橋梁,進而影響CDK6蛋白,從而對內(nèi)異癥產(chǎn)生作用,即HSP90AB1可能是CDK6的下游靶基因之一,有待進一步驗證。
【圖文】：

中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文3 結(jié)果3.1 子宮內(nèi)膜異位癥患者異位及在位內(nèi)膜組織中 AC002454.1 和CDK6 mRNA 表達情況qRT-PCR 檢測子宮內(nèi)膜組織中 AC002454.1 和 CDK6 mRNA 表達情況。結(jié)果見圖 1.1A，GAPDH 作為內(nèi)參，內(nèi)異癥在位內(nèi)膜組織中 AC002454.1 和 CDK6mRNA 表達高于正常內(nèi)膜組織（P<0.05），而內(nèi)異癥患者異位內(nèi)膜組織和在位內(nèi)膜組織之間表達差異并不顯著（P > 0.05）。對 AC002454.1 和 CDK6 mRNA 在內(nèi)異癥在位內(nèi)膜組織與正常內(nèi)膜組織中的表達量進行相關(guān)性分析，結(jié)果見圖1.1B，AC002454.1 和 CDK6 mRNA 相對表達量呈正相關(guān)（Pearson 相關(guān)系數(shù)為：0.691，P<0.001）。

圖 1.2 子宮內(nèi)膜組織 CDK6 蛋白表達圖中 A 為子宮內(nèi)膜組織中 CDK6 蛋白電泳圖；B 為 CDK6 蛋白在子宮內(nèi)膜組織相對表達量。NE：正常子宮內(nèi)膜組織，EU：內(nèi)異癥在位內(nèi)膜組織，EC：異位內(nèi)膜組織。3.2.2 免疫組化檢測情況免疫組化結(jié)果提示：CDK6 蛋白主要表達在間質(zhì)細胞的細胞質(zhì)及細胞核中（圖 1.3）。正常內(nèi)膜組織中 CDK6 蛋白表達的陽性率為 25.0%，內(nèi)異癥在位內(nèi)膜組織和異位內(nèi)膜組織 CDK6 蛋白陽性率分別為 73.0%和 66.7%。該結(jié)果表明，，內(nèi)異癥患者在位內(nèi)膜中 CDK6 蛋白的陽性表達率明顯高于正常子宮內(nèi)膜（P<0.05），而異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜之間無顯著差異（P > 0.05）（表 1.2）。
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R711.71

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 馬琰;;子宮內(nèi)膜異位癥的在位內(nèi)膜病變研究進展[J];中國繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育;2015年17期

2 沈芳榮;劉明;何影娟;馮亞紅;;子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜孕激素受體及黏蛋白-1的表達[J];中國婦幼保健;2013年14期

3 金海燕;周龍書;;正常和子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜的對比研究[J];海南醫(yī)學(xué);2011年13期

4 仝佳麗;郎景和;;子宮內(nèi)膜異位癥的在位內(nèi)膜病變研究進展[J];現(xiàn)代婦產(chǎn)科進展;2010年06期

5 任黔川,莊琳,徐小蓉,伍宗惠;血管內(nèi)皮生長因子和堿性成纖維細胞生長因子在子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜的表達[J];中國煤炭工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志;2003年01期

6 婁潔;王丹波;;子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜分子水平研究進展[J];國外醫(yī)學(xué)(婦產(chǎn)科學(xué)分冊);2007年01期

7 李華軍;郎景和;劉珠鳳;孫大為;冷金花;朱蘭;;子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜細胞對雌二醇超敏狀態(tài)的研究[J];現(xiàn)代婦產(chǎn)科進展;2007年06期

8 李華軍;郎景和;劉珠鳳;孫大為;冷金花;朱蘭;;子宮內(nèi)膜異位癥患者在位內(nèi)膜細胞的異常生物學(xué)特性[J];中日友好醫(yī)院學(xué)報;2007年06期

9 王建華,周馥貞,董e

本文編號：2711035