【摘要】：第一部分盤狀結(jié)構(gòu)域受體1在卵巢癌組織中的表達及臨床意義目的探討人卵巢癌組織中盤狀結(jié)構(gòu)域受體1(DDR1)蛋白的表達情況及其臨床意義。方法運用免疫組化法檢測33例正常卵巢組織、43例卵巢良性腫瘤組織及94例卵巢癌組織中的DDR1蛋白表達情況,比較不同臨床病理特征卵巢癌病人的DDR1蛋白陽性表達率,分析DDR1蛋白陽性表達與卵巢癌病人病理特征及預后的關(guān)系。結(jié)果卵巢癌組織的陽性表達率[55.32%(52/94)]均高于正常卵巢組織[0(0/33)]、卵巢良性腫瘤組織[11.63%(5/43)](均P0.05),而正常卵巢組織與良性卵巢腫瘤組織的陽性表達率比較,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。FIGOⅢ~Ⅳ期、低分化、有腹腔轉(zhuǎn)移病人的DDR1蛋白的表達陽性率[60.98%(50/82)、62.16%(46/74)、66.67%(42/63)]分別高于FIGOⅠ~Ⅱ期、中-高分化者、無腹腔轉(zhuǎn)移的病人的陽性表達率[16.67%(2/12)、30%(6/20)、32.26(10/31)](均P0.05)。卵巢癌組織中DDR1蛋白的陽性表達及腹腔轉(zhuǎn)移是卵巢癌患者死亡的危險因素(P0.05)。結(jié)論DDR1蛋白在卵巢癌組織中呈高表達,其可能參與了卵巢癌的發(fā)生發(fā)展與遠處轉(zhuǎn)移,或可成為評估患者預后的重要因素。第二部分外源性Collagen I誘導下TM4SF1對高轉(zhuǎn)移性卵巢癌細胞HO8910PM生物學行為影響的體外研究目的研究外源性Collagen I誘導下TM4SF1對高轉(zhuǎn)移性卵巢癌細胞H O8910PM的體外生物學行為的影響。方法慢病毒轉(zhuǎn)染RNAi抑制TM4SF1在HO8910PM的表達,RT-PCR以及Western Blot技術(shù)檢測RNAi后細胞中TM4SF1基因蛋白的表達情況。細胞免疫熒光方法檢測在有無外源性Collagen I的存在下TM4SF1與DDR1在HO8910PM中的定位,Transwell遷移和侵襲實驗檢測細胞遷移與侵襲能力的改變。結(jié)果成功構(gòu)建了靶向沉默TM4SF1并同時表達GFP熒光的慢病毒載體,感染并篩選出穩(wěn)定表達細胞株LV-TM4SF1-RNAi-GFP-HO8910PM以及陰性對照LV-CON-TM4SF1-GFP-HO8910PM。RT-PCR實驗表明TM4SF1基因在m RNA水平沉默效率約為65%,Western Blot檢測TM4SF1蛋白沉默效率約為70%。免疫熒光結(jié)果顯示TM4SF1及DDR1均為細胞膜蛋白,當有外源性Collagen I存在時,TM4SF1可使DDR1在細胞膜上聚集,同時伴隨TM4SF1聚集。Transwell遷移實驗表明:LV-RNAi-TM4SF1-GFP-H O8910PM組細胞穿過Transwell小室的細胞數(shù)為94.667±9.018,較HO8910PM組(257.667±17.898)及LV-CON-TM4SF1-GFP-HO8910PM組(261.667±29.023)明顯下降(P0.05);LV-RNAi-TM4SF1-GFP-HO8910PM在有50μg/ml Collagen I存在的條件下,細胞穿過Transwell小室的細胞數(shù)為150.667±7.371,與HO8910PM+50μg/ml Collagen I組(370.000±16.523)及LV-CON-TM4SF1-GFP-HO8910PM+50μg/ml Collagen I組(377.333±15.948)相比較明顯下降(均P0.05)。當有外源性Collagen I存在時,HO8910PM、LV-RNAi-TM4SF1-GFP-HO8910PM、LV-CON-TM4SF1-GFP-HO8910PM細胞穿過Transwell小室的細胞數(shù)均較無外源性Collagen I存在時明顯增加(均P0.05)。Transwell侵襲實驗表明:LV-RNAi-TM4SF1-GFP-HO8910PM組細胞穿過鋪設(shè)Matrigel的Transwell小室的細胞數(shù)為57.00±5.568,較HO8910PM組(134.333±6.658)及LV-CON-TM4SF1-GFP-HO8910PM組(141.333±7.638)明顯下降(均P0.05),LV-RNAi-TM4SF1-GFP-HO8910PM在有外源性Collagen I存在的條件下,細胞穿過鋪設(shè)Matrigel的Tr answell小室的細胞數(shù)為109.000±4.359,與HO8910PM+50μg/ml Collagen I組(216.333±16.921)及LV-CON-TM4SF1-GFP-HO8910PM+50μg/ml Co llagen I組(226.667±4.509)相比較明顯下降(均P0.05)。當有外源性C ollagen I存在時,HO8910PM、LV-RNAi-TM4SF1-GFP-HO8910PM、LV-C ON-TM4SF1-GFP-HO8910PM細胞穿過鋪設(shè)Matrigel的Transwell小室的細胞數(shù)均較無外源性Collagen I存在時明顯增加(均P0.05)。結(jié)論TM4SF1與DDR1均為細胞膜蛋白,TM4SF1可以在外源性Collagen I存在的條件下使DDR1在細胞膜上聚集,同時伴隨TM4SF1聚集。下調(diào)TM4SF1的表達可以抑制卵巢癌HO8910PM細胞的遷移以及侵襲能力。外源性Collagen I的存在可以促進卵巢癌HO8910PM細胞的遷移以及侵襲。第三部分外源性Collagen I誘導下DDR1對高轉(zhuǎn)移性卵巢癌細胞HO8910PM生物學行為影響的體外研究目的研究外源性Collagen I誘導下DDR1對高轉(zhuǎn)移性卵巢癌細胞HO8910PM的體外生物學行為的影響。方法慢病毒轉(zhuǎn)染RNAi抑制DDR1在HO8910PM的表達,RT-PCR以及Western Blot檢測干擾效率,Transwell遷移和侵襲實驗檢測細胞遷移與侵襲能力的改變。結(jié)果RT-PCR與Western結(jié)果顯示,LV-DDR1-RNAi-mcherry-2沉默D DR1效果最佳,RT-PCR實驗表明DDR1基因在m RNA水平沉默效率約為85%,Western Blot檢測DDR1蛋白沉默效率約為95%。用其感染并篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株LV-DDR1-RNAi-mcherry-HO8910PM以及陰性對照LV-CO N-DDR1-mcherry-HO8910PM。Transwell遷移實驗表明:LV-RNAi-DDR1-mcherry-HO8910PM組細胞穿過Transwell小室的細胞數(shù)為99.000±5.292,較HO8910PM組(160.333±6.028)及LV-CON-DDR1-mcherry-HO8910PM組(161.000±4.583)明顯下降(均P0.05),LV-DDR1-RNAi-mcherry-HO8910PM在有50μg/ml Collagen I存在的條件下,細胞穿過Transwell小室的細胞數(shù)為150.667±5.508,與HO8910PM+50μg/ml Collagen I組(239.000±10.583)及LV-CON-DDR1-mcherry-HO8910PM+50μg/ml Collagen I組(237.667±8.386)相比較明顯下降(均P0.05)。Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示:LV-RNAi-DDR1-mcherry-HO8910PM組細胞穿過鋪設(shè)Matrigel的Tra nswell小室的細胞數(shù)為66.000±6.557,較HO8910PM組(126.667±6.506)及LV-CON-DDR1-mcherry-HO8910PM組(133.667±7.572)明顯下降(均P0.05)LV-RNAi-DDR1-mcherry-HO8910PM在有50μg/ml Collagen I存在的條件下,穿過鋪設(shè)Matrigel的Transwell小室的細胞數(shù)為117.000±7.211,與HO8910PM+50μg/ml Collagen I組(180.000±2.646)及LV-CON-DDR1-mcherry-HO8910PM+50μg/ml Collagen I組(190.000±9.849)相比較明顯下降(均P0.05)。當有外源性Collagen I存在時,HO8910PM、LV-RNAi-DDR1-mcherry-HO8910PM、LV-CON-DDR1-mcherry-HO8910PM細胞穿過鋪設(shè)Matrigel的Transwell小室的細胞數(shù)均較無外源性Collagen I存在時明顯增加(均P0.05)。結(jié)論下調(diào)DDR1的表達可以抑制卵巢癌HO8910PM細胞的遷移以及侵襲能力。外源性Collagen I的存在可以促進卵巢癌HO8910PM細胞的遷移以及侵襲。
【圖文】：

DDR1 蛋白在正常卵巢上皮細胞未見表達，部分區(qū)域見有極淺黃色著色區(qū)域，，按 IRS 評分標準為陰性；DDR1 蛋白在良性卵巢腫瘤細胞中的表達主要集中在細胞膜上，細胞質(zhì)也可看見淺棕黃色著色；而 DDR1 蛋白在卵巢癌細胞中則細胞膜及胞漿中均可見著色顆粒分布。見圖 1-1。DDR1 蛋白在正常卵巢癌組織、良性卵巢腫瘤組織及卵巢癌組織中的陽性表達率分別為 0、11.63%（5/43）、55.32%（52/94），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=45.926，P<0.001），其中卵巢癌組織的陽性表達率均高于其他組織(均 P<0.05)，而正常卵巢癌組織與良性卵巢腫瘤組織的陽性表達率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表 1-1。AB CA

圖 2-1：熒光顯微鏡下不同濃度的慢病毒感染 HO8910PM 的感染效率（200×）Fig 2-1 Infection efficiency under microscope after different Virus concentration gradient（200×）2.1.2 慢病毒感染 HO891OPM 的正式實驗將 LV-TM4SF1-RNAi-GFP 以及 LV- TM4SF1-CON-GFP 按 MOI=20 感染HO8910PM，72 小時后觀察轉(zhuǎn)染效率，感染效率達到 90%以上，見圖 2-2。LV-TM4SF1-RNAi-GFP-HO8910PM LV-TM4SF1-CON-GFP-HO8910PMLight GFP Light GFP
【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R737.31

【參考文獻】

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本文編號：2706622