【摘要】：第一部分盤(pán)狀結(jié)構(gòu)域受體1在卵巢癌組織中的表達(dá)及臨床意義目的探討人卵巢癌組織中盤(pán)狀結(jié)構(gòu)域受體1(DDR1)蛋白的表達(dá)情況及其臨床意義。方法運(yùn)用免疫組化法檢測(cè)33例正常卵巢組織、43例卵巢良性腫瘤組織及94例卵巢癌組織中的DDR1蛋白表達(dá)情況,比較不同臨床病理特征卵巢癌病人的DDR1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率,分析DDR1蛋白陽(yáng)性表達(dá)與卵巢癌病人病理特征及預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果卵巢癌組織的陽(yáng)性表達(dá)率[55.32%(52/94)]均高于正常卵巢組織[0(0/33)]、卵巢良性腫瘤組織[11.63%(5/43)](均P0.05),而正常卵巢組織與良性卵巢腫瘤組織的陽(yáng)性表達(dá)率比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。FIGOⅢ~Ⅳ期、低分化、有腹腔轉(zhuǎn)移病人的DDR1蛋白的表達(dá)陽(yáng)性率[60.98%(50/82)、62.16%(46/74)、66.67%(42/63)]分別高于FIGOⅠ~Ⅱ期、中-高分化者、無(wú)腹腔轉(zhuǎn)移的病人的陽(yáng)性表達(dá)率[16.67%(2/12)、30%(6/20)、32.26(10/31)](均P0.05)。卵巢癌組織中DDR1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)及腹腔轉(zhuǎn)移是卵巢癌患者死亡的危險(xiǎn)因素(P0.05)。結(jié)論DDR1蛋白在卵巢癌組織中呈高表達(dá),其可能參與了卵巢癌的發(fā)生發(fā)展與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,或可成為評(píng)估患者預(yù)后的重要因素。第二部分外源性Collagen I誘導(dǎo)下TM4SF1對(duì)高轉(zhuǎn)移性卵巢癌細(xì)胞HO8910PM生物學(xué)行為影響的體外研究目的研究外源性Collagen I誘導(dǎo)下TM4SF1對(duì)高轉(zhuǎn)移性卵巢癌細(xì)胞H O8910PM的體外生物學(xué)行為的影響。方法慢病毒轉(zhuǎn)染RNAi抑制TM4SF1在HO8910PM的表達(dá),RT-PCR以及Western Blot技術(shù)檢測(cè)RNAi后細(xì)胞中TM4SF1基因蛋白的表達(dá)情況。細(xì)胞免疫熒光方法檢測(cè)在有無(wú)外源性Collagen I的存在下TM4SF1與DDR1在HO8910PM中的定位,Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移與侵襲能力的改變。結(jié)果成功構(gòu)建了靶向沉默TM4SF1并同時(shí)表達(dá)GFP熒光的慢病毒載體,感染并篩選出穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株LV-TM4SF1-RNAi-GFP-HO8910PM以及陰性對(duì)照LV-CON-TM4SF1-GFP-HO8910PM。RT-PCR實(shí)驗(yàn)表明TM4SF1基因在m RNA水平沉默效率約為65%,Western Blot檢測(cè)TM4SF1蛋白沉默效率約為70%。免疫熒光結(jié)果顯示TM4SF1及DDR1均為細(xì)胞膜蛋白,當(dāng)有外源性Collagen I存在時(shí),TM4SF1可使DDR1在細(xì)胞膜上聚集,同時(shí)伴隨TM4SF1聚集。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)表明:LV-RNAi-TM4SF1-GFP-H O8910PM組細(xì)胞穿過(guò)Transwell小室的細(xì)胞數(shù)為94.667±9.018,較HO8910PM組(257.667±17.898)及LV-CON-TM4SF1-GFP-HO8910PM組(261.667±29.023)明顯下降(P0.05);LV-RNAi-TM4SF1-GFP-HO8910PM在有50μg/ml Collagen I存在的條件下,細(xì)胞穿過(guò)Transwell小室的細(xì)胞數(shù)為150.667±7.371,與HO8910PM+50μg/ml Collagen I組(370.000±16.523)及LV-CON-TM4SF1-GFP-HO8910PM+50μg/ml Collagen I組(377.333±15.948)相比較明顯下降(均P0.05)。當(dāng)有外源性Collagen I存在時(shí),HO8910PM、LV-RNAi-TM4SF1-GFP-HO8910PM、LV-CON-TM4SF1-GFP-HO8910PM細(xì)胞穿過(guò)Transwell小室的細(xì)胞數(shù)均較無(wú)外源性Collagen I存在時(shí)明顯增加(均P0.05)。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)表明:LV-RNAi-TM4SF1-GFP-HO8910PM組細(xì)胞穿過(guò)鋪設(shè)Matrigel的Transwell小室的細(xì)胞數(shù)為57.00±5.568,較HO8910PM組(134.333±6.658)及LV-CON-TM4SF1-GFP-HO8910PM組(141.333±7.638)明顯下降(均P0.05),LV-RNAi-TM4SF1-GFP-HO8910PM在有外源性Collagen I存在的條件下,細(xì)胞穿過(guò)鋪設(shè)Matrigel的Tr answell小室的細(xì)胞數(shù)為109.000±4.359,與HO8910PM+50μg/ml Collagen I組(216.333±16.921)及LV-CON-TM4SF1-GFP-HO8910PM+50μg/ml Co llagen I組(226.667±4.509)相比較明顯下降(均P0.05)。當(dāng)有外源性C ollagen I存在時(shí),HO8910PM、LV-RNAi-TM4SF1-GFP-HO8910PM、LV-C ON-TM4SF1-GFP-HO8910PM細(xì)胞穿過(guò)鋪設(shè)Matrigel的Transwell小室的細(xì)胞數(shù)均較無(wú)外源性Collagen I存在時(shí)明顯增加(均P0.05)。結(jié)論TM4SF1與DDR1均為細(xì)胞膜蛋白,TM4SF1可以在外源性Collagen I存在的條件下使DDR1在細(xì)胞膜上聚集,同時(shí)伴隨TM4SF1聚集。下調(diào)TM4SF1的表達(dá)可以抑制卵巢癌HO8910PM細(xì)胞的遷移以及侵襲能力。外源性Collagen I的存在可以促進(jìn)卵巢癌HO8910PM細(xì)胞的遷移以及侵襲。第三部分外源性Collagen I誘導(dǎo)下DDR1對(duì)高轉(zhuǎn)移性卵巢癌細(xì)胞HO8910PM生物學(xué)行為影響的體外研究目的研究外源性Collagen I誘導(dǎo)下DDR1對(duì)高轉(zhuǎn)移性卵巢癌細(xì)胞HO8910PM的體外生物學(xué)行為的影響。方法慢病毒轉(zhuǎn)染RNAi抑制DDR1在HO8910PM的表達(dá),RT-PCR以及Western Blot檢測(cè)干擾效率,Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移與侵襲能力的改變。結(jié)果RT-PCR與Western結(jié)果顯示,LV-DDR1-RNAi-mcherry-2沉默D DR1效果最佳,RT-PCR實(shí)驗(yàn)表明DDR1基因在m RNA水平沉默效率約為85%,Western Blot檢測(cè)DDR1蛋白沉默效率約為95%。用其感染并篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株LV-DDR1-RNAi-mcherry-HO8910PM以及陰性對(duì)照LV-CO N-DDR1-mcherry-HO8910PM。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)表明:LV-RNAi-DDR1-mcherry-HO8910PM組細(xì)胞穿過(guò)Transwell小室的細(xì)胞數(shù)為99.000±5.292,較HO8910PM組(160.333±6.028)及LV-CON-DDR1-mcherry-HO8910PM組(161.000±4.583)明顯下降(均P0.05),LV-DDR1-RNAi-mcherry-HO8910PM在有50μg/ml Collagen I存在的條件下,細(xì)胞穿過(guò)Transwell小室的細(xì)胞數(shù)為150.667±5.508,與HO8910PM+50μg/ml Collagen I組(239.000±10.583)及LV-CON-DDR1-mcherry-HO8910PM+50μg/ml Collagen I組(237.667±8.386)相比較明顯下降(均P0.05)。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:LV-RNAi-DDR1-mcherry-HO8910PM組細(xì)胞穿過(guò)鋪設(shè)Matrigel的Tra nswell小室的細(xì)胞數(shù)為66.000±6.557,較HO8910PM組(126.667±6.506)及LV-CON-DDR1-mcherry-HO8910PM組(133.667±7.572)明顯下降(均P0.05)LV-RNAi-DDR1-mcherry-HO8910PM在有50μg/ml Collagen I存在的條件下,穿過(guò)鋪設(shè)Matrigel的Transwell小室的細(xì)胞數(shù)為117.000±7.211,與HO8910PM+50μg/ml Collagen I組(180.000±2.646)及LV-CON-DDR1-mcherry-HO8910PM+50μg/ml Collagen I組(190.000±9.849)相比較明顯下降(均P0.05)。當(dāng)有外源性Collagen I存在時(shí),HO8910PM、LV-RNAi-DDR1-mcherry-HO8910PM、LV-CON-DDR1-mcherry-HO8910PM細(xì)胞穿過(guò)鋪設(shè)Matrigel的Transwell小室的細(xì)胞數(shù)均較無(wú)外源性Collagen I存在時(shí)明顯增加(均P0.05)。結(jié)論下調(diào)DDR1的表達(dá)可以抑制卵巢癌HO8910PM細(xì)胞的遷移以及侵襲能力。外源性Collagen I的存在可以促進(jìn)卵巢癌HO8910PM細(xì)胞的遷移以及侵襲。
【圖文】：

DDR1 蛋白在正常卵巢上皮細(xì)胞未見(jiàn)表達(dá)，部分區(qū)域見(jiàn)有極淺黃色著色區(qū)域，，按 IRS 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為陰性；DDR1 蛋白在良性卵巢腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)主要集中在細(xì)胞膜上，細(xì)胞質(zhì)也可看見(jiàn)淺棕黃色著色；而 DDR1 蛋白在卵巢癌細(xì)胞中則細(xì)胞膜及胞漿中均可見(jiàn)著色顆粒分布。見(jiàn)圖 1-1。DDR1 蛋白在正常卵巢癌組織、良性卵巢腫瘤組織及卵巢癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為 0、11.63%（5/43）、55.32%（52/94），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=45.926，P<0.001），其中卵巢癌組織的陽(yáng)性表達(dá)率均高于其他組織(均 P<0.05)，而正常卵巢癌組織與良性卵巢腫瘤組織的陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表 1-1。AB CA

圖 2-1：熒光顯微鏡下不同濃度的慢病毒感染 HO8910PM 的感染效率（200×）Fig 2-1 Infection efficiency under microscope after different Virus concentration gradient（200×）2.1.2 慢病毒感染 HO891OPM 的正式實(shí)驗(yàn)將 LV-TM4SF1-RNAi-GFP 以及 LV- TM4SF1-CON-GFP 按 MOI=20 感染HO8910PM，72 小時(shí)后觀察轉(zhuǎn)染效率，感染效率達(dá)到 90%以上，見(jiàn)圖 2-2。LV-TM4SF1-RNAi-GFP-HO8910PM LV-TM4SF1-CON-GFP-HO8910PMLight GFP Light GFP
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R737.31

【參考文獻(xiàn)】

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1 趙冰冰;陽(yáng)志軍;王琪;潘忠勉;張瑋;李力;;多指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)的液態(tài)懸浮芯片技術(shù)在卵巢惡性腫瘤診斷中的應(yīng)用[J];中華婦產(chǎn)科雜志;2017年01期

2 劉兆紅;齊鳳杰;趙樹(shù)鵬;;乳腺癌中ING4和MMP-9相關(guān)性及臨床應(yīng)用價(jià)值[J];醫(yī)學(xué)與哲學(xué)(B);2016年02期

3 高彩云;劉慧敏;黃再銘;陽(yáng)志軍;;慢病毒介導(dǎo)干擾TM4SF1基因表達(dá)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞體外生物學(xué)行為的影響[J];現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展;2015年02期

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5 劉慧敏;俸艷英;高彩云;陽(yáng)志軍;;TM4SF1蛋白在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)及其臨床意義[J];中國(guó)癌癥防治雜志;2014年01期

6 俸艷英;陽(yáng)志軍;李力;張瑋;;TM4SF1 mRNA在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)及其臨床價(jià)值[J];廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2013年03期

7 陽(yáng)志軍;楊光;蔣燕明;冉宇靚;楊治華;張瑋;張潔清;潘忠勉;李力;;卵巢上皮性癌相關(guān)抗原的篩選和血清學(xué)檢測(cè)[J];中華婦產(chǎn)科雜志;2007年12期

本文編號(hào)：2706622