【摘要】：目的:在婦科惡性腫瘤中,卵巢癌(ovarian cancer,OC)的發(fā)病率僅次于子宮頸癌和子宮體癌,而死亡率位居首位。因卵巢解剖部位隱蔽,早期缺乏典型的臨床癥狀和可靠的檢測方法,多數(shù)患者在發(fā)現(xiàn)及診斷出卵巢癌時已處于疾病晚期。目前針對卵巢癌的有效靶向治療仍然是婦科臨床醫(yī)師亟需思考的問題,其耐藥機制的研究也一直是近幾年來的研究重點。本研究主要探討乳腺癌1號基因(breast cancer 1,BRCA1)、自噬與卵巢癌順鉑耐藥之間的關系,化療耐藥的上皮源性卵巢癌干細胞(epithelial ovarian cancer stem cells,EOCSCs)中自噬相關基因及蛋白表達的改變及調節(jié)BRCA1表達后自噬水平及耐藥性變化的機理,進而豐富卵巢癌病因學理論,為卵巢癌這種發(fā)病率高、惡性程度高、死亡例數(shù)高的婦科腫瘤的治療提供新思路。研究方法:1、利用Realtime PCR方法和Western Blot方法檢測BRCA1在人卵巢癌化療敏感組織標本和化療耐藥組織標本中的表達,并結合組織樣本信息進行臨床病理學參數(shù)分析。利用Realtime PCR方法檢測卵巢癌組織中自噬及耐藥相關基因的表達;利用Western Blot法檢測卵巢癌組織中自噬調節(jié)蛋白、自噬標記蛋白以及干細胞標記蛋白的表達;分析卵巢癌組織樣本中BRCA1和耐藥相關基因表達的相關性。2、培養(yǎng)人卵巢癌細胞系SKOV3,采用無血清懸浮球方法富集SKOV3-EOCSCs。利用流式細胞術檢測EOCSCs表面干細胞標記物的表達;利用Realtime PCR方法檢測EOCSCs中細胞干性及耐藥相關基因的表達;利用Western Blot方法檢測EOCSCs中干細胞標記蛋白的表達;通過CCK-8法和EdU實驗檢測EOCSCs的細胞活力和增殖活性;利用Realtime PCR和Western Blot方法檢測EOCSCs中BRCA1的表達;利用Western Blot方法檢測耐藥相關蛋白的表達和LC3-II/I比值;通過mRFP-GFP-LC3雙標腺病毒轉染的方法檢測自噬流強度。3、構建BRCA1過表達載體,轉染到EOCSCs中并通過Western Blot方法對轉染效率進行驗證。利用Western Blot方法檢測自噬調節(jié)蛋白、自噬標記蛋白耐藥相關蛋白以及干細胞標記蛋白的表達;通過mRFP-GFP-LC3雙標腺病毒轉染的方法檢測自噬流強度;利用流式細胞術檢測細胞在順鉑處理后的凋亡水平。將BRCA1過表達質粒轉染到貼壁的人卵巢癌細胞系SKOV3中,并利用流式細胞術檢測細胞表面干細胞標記物的表達。構建si-BECN1、si-ATG5,敲低自噬調節(jié)基因,將各組siRNA分別轉染至EOCSCs中,并通過Realtime PCR和Western Blot的方法對轉染效率進行驗證。利用流式細胞術檢測各組細胞在順鉑處理后的凋亡水平。4、構建BRCA1表達敲低慢病毒載體,將慢病毒轉染至EOCSCs中,通過Western Blot方法驗證轉染效率并通過熒光顯微鏡觀察轉染情況。自噬激活實驗:2.5μM Torkinib(PP242)作用24 h,100nM Rapamycin作用36h,激活自噬后開始順鉑干預;自噬抑制實驗:100μM Chloroquine作用48 h,100mM 3-methyladenosine作用24 h,抑制自噬后開始順鉑干預。在BRCA1不同表達水平的EOCSCs中調節(jié)自噬活性,通過CCK-8法檢測各組細胞的細胞活力和增殖活性;利用流式細胞術檢測各組細胞的細胞周期。最后利用Western Blot方法檢測各組EOCSCs中BRCA1、自噬調節(jié)蛋白、干細胞標記蛋白和耐藥相關蛋白的表達變化以及LC3-II/I比值變化。結果:1、BRCA1在人卵巢癌化療耐藥組織中表達顯著上調;BECN1、ATG5、ATG7、ABCG2、ABCB1的mRNA水平在化療耐藥卵巢癌組織中明顯高于化療敏感卵巢癌組織,Beclin-1、ATG5、POU5F1、NANOG的蛋白表達水平在化療耐藥卵巢癌組織中明顯高于化療敏感卵巢癌組織,LC3-II/I比值明顯增高,ATG7表達增高不顯著,p62表達水平變化無統(tǒng)計學意義;卵巢癌組織中BRCA1與ABCG2基因表達水平存在正相關。2、通過無血清懸浮球方法能夠從人卵巢癌細胞系SKOV3中分離和富集EOCSCs,且與SKOV3細胞系相比EOCSCs擁有更強的細胞活力和增殖能力,高表達的干細胞相關因子CD44、CD133、POU5F1、NANOG,高表達的耐藥相關蛋白P-gp、ABCG2和更強的耐藥性,以及高表達的BRCA1和更高的自噬通量。3、以EOCSCs為工具細胞,過表達BRCA1顯著促進了自噬的發(fā)生和發(fā)展,ATG5、Beclin-1蛋白水平明顯增高,ATG7變化不顯著,自噬流明顯增強;過表達BRCA1能夠上調耐藥相關蛋白P-gp、ABCG2的表達,對TP53-BP1的調節(jié)作用不明顯;隨著BRCA1表達和自噬水平的增高,干細胞相關標記蛋白POU5F1和NANOG的表達明顯增高。在貼壁的SKOV3細胞中上調BRCA1后,干細胞相關表面標記物CD44的表達有明顯增高。在順鉑作用下,過表達BRCA1能夠抑制EOCSCs的凋亡,敲低自噬調節(jié)基因BECN1和自噬相關基因ATG5能夠促進凋亡。4、沉默BRCA1顯著降低了EOCSCs的細胞活力,細胞周期出現(xiàn)G2/M期阻滯;激活自噬后細胞活力出現(xiàn)明顯增加,G2/M期阻滯程度有所緩解;抑制自噬活性后,細胞活力出現(xiàn)明顯減弱,G2/M期阻滯程度增加,出現(xiàn)明顯凋亡峰。沉默BRCA1通過負性調節(jié)Beclin-1表達,抑制LC3-I向LC3-II轉化,阻礙自噬發(fā)生發(fā)展進程,進而抑制P-gp表達,降低EOCSCs耐藥性,同時對卵巢癌細胞的干細胞特性轉化起到負向調節(jié)作用;激活自噬后BRCA1表達降低。結論:1、BRCA1在化療耐藥的卵巢癌組織和EOCSCs中表達,BRCA1呈高表達,且化療耐藥的卵巢癌組織具有較高水平的基礎自噬。2、利用無血清懸浮球方法從人卵巢癌細胞系SKOV3中分離并富集EOCSCs,能夠表達多能干細胞表面標記CD44、CD133和干細胞相關因子POU5F1、NANOG,且EOCSCs與親本細胞相比具有較高的細胞活力和增殖能力,較高的自噬水平及耐藥能力。3、BRCA1可以通過正向調節(jié)自噬的發(fā)生發(fā)展,增強EOCSCs的細胞活力和促進增殖、抑制細胞凋亡、緩解細胞周期G2/M期阻滯、增強耐藥性以及促進干細胞特性轉化。激活自噬能夠一定程度上降低BRCA1表達,兩者存在相互調節(jié)作用。
【圖文】：

中國醫(yī)科大學博士學位論文.3 耐藥相關基因 ABCG2、ABCB1 在卵巢癌化療耐藥組織和敏感組的差異性表達為了驗證卵巢癌樣本的耐藥性，在鉑類耐受和鉑類敏感性卵巢癌組織中通ealtime PCR 方法檢測 ABCG2 和 ABCB1 的 mRNA 水平。結果顯示，在耐藥組 ABCG2 和 ABCB1 的 mRNA 水平均高于敏感組織（圖 1.2）。

圖 1.3 BRCA1 與 ABCG2、ABCB1 在卵巢癌組織中的相關性研究A：漿液性卵巢癌組織中 ABCG2 水平與 BRCA1 水平的相關性；B：漿液性卵巢癌組織中ABCB1 水平與 BRCA1 水平的相關性。N=20。散點圖中的每個點代表一個獨立樣本的相對表達。3.5 自噬相關因子在卵巢癌化療耐藥組織和敏感組織中的差異性表達Realtime PCR 結果顯示 BECN1，ATG5 和 ATG7 的 mRNA 水平在耐藥組織中高于敏感組織（圖 1.4 A,E,G）。Western Blot 結果顯示 Beclin-1，，ATG5 和 LC3II/I 在耐藥組織中的表達顯著高于敏感組織（圖 1.4 B,F,D）。ATG7 的表達略有增加趨勢，自噬底物 p62 表達有下降的趨勢（圖 1.4 H,C），差異無統(tǒng)計學意義。這些結果表明 BRCA1 和自噬可能參與卵巢癌耐藥的發(fā)展和維持。3.6 干細胞相關因子 POU5F1 和 NANOG 在卵巢癌化療耐藥組織和敏
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R737.31

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本文編號：2700203