【摘要】：目的:在婦科惡性腫瘤中,卵巢癌(ovarian cancer,OC)的發(fā)病率僅次于子宮頸癌和子宮體癌,而死亡率位居首位。因卵巢解剖部位隱蔽,早期缺乏典型的臨床癥狀和可靠的檢測方法,多數(shù)患者在發(fā)現(xiàn)及診斷出卵巢癌時(shí)已處于疾病晚期。目前針對卵巢癌的有效靶向治療仍然是婦科臨床醫(yī)師亟需思考的問題,其耐藥機(jī)制的研究也一直是近幾年來的研究重點(diǎn)。本研究主要探討乳腺癌1號基因(breast cancer 1,BRCA1)、自噬與卵巢癌順鉑耐藥之間的關(guān)系,化療耐藥的上皮源性卵巢癌干細(xì)胞(epithelial ovarian cancer stem cells,EOCSCs)中自噬相關(guān)基因及蛋白表達(dá)的改變及調(diào)節(jié)BRCA1表達(dá)后自噬水平及耐藥性變化的機(jī)理,進(jìn)而豐富卵巢癌病因?qū)W理論,為卵巢癌這種發(fā)病率高、惡性程度高、死亡例數(shù)高的婦科腫瘤的治療提供新思路。研究方法:1、利用Realtime PCR方法和Western Blot方法檢測BRCA1在人卵巢癌化療敏感組織標(biāo)本和化療耐藥組織標(biāo)本中的表達(dá),并結(jié)合組織樣本信息進(jìn)行臨床病理學(xué)參數(shù)分析。利用Realtime PCR方法檢測卵巢癌組織中自噬及耐藥相關(guān)基因的表達(dá);利用Western Blot法檢測卵巢癌組織中自噬調(diào)節(jié)蛋白、自噬標(biāo)記蛋白以及干細(xì)胞標(biāo)記蛋白的表達(dá);分析卵巢癌組織樣本中BRCA1和耐藥相關(guān)基因表達(dá)的相關(guān)性。2、培養(yǎng)人卵巢癌細(xì)胞系SKOV3,采用無血清懸浮球方法富集SKOV3-EOCSCs。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測EOCSCs表面干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá);利用Realtime PCR方法檢測EOCSCs中細(xì)胞干性及耐藥相關(guān)基因的表達(dá);利用Western Blot方法檢測EOCSCs中干細(xì)胞標(biāo)記蛋白的表達(dá);通過CCK-8法和EdU實(shí)驗(yàn)檢測EOCSCs的細(xì)胞活力和增殖活性;利用Realtime PCR和Western Blot方法檢測EOCSCs中BRCA1的表達(dá);利用Western Blot方法檢測耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá)和LC3-II/I比值;通過mRFP-GFP-LC3雙標(biāo)腺病毒轉(zhuǎn)染的方法檢測自噬流強(qiáng)度。3、構(gòu)建BRCA1過表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染到EOCSCs中并通過Western Blot方法對轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行驗(yàn)證。利用Western Blot方法檢測自噬調(diào)節(jié)蛋白、自噬標(biāo)記蛋白耐藥相關(guān)蛋白以及干細(xì)胞標(biāo)記蛋白的表達(dá);通過mRFP-GFP-LC3雙標(biāo)腺病毒轉(zhuǎn)染的方法檢測自噬流強(qiáng)度;利用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞在順鉑處理后的凋亡水平。將BRCA1過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到貼壁的人卵巢癌細(xì)胞系SKOV3中,并利用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)。構(gòu)建si-BECN1、si-ATG5,敲低自噬調(diào)節(jié)基因,將各組siRNA分別轉(zhuǎn)染至EOCSCs中,并通過Realtime PCR和Western Blot的方法對轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行驗(yàn)證。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞在順鉑處理后的凋亡水平。4、構(gòu)建BRCA1表達(dá)敲低慢病毒載體,將慢病毒轉(zhuǎn)染至EOCSCs中,通過Western Blot方法驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率并通過熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染情況。自噬激活實(shí)驗(yàn):2.5μM Torkinib(PP242)作用24 h,100nM Rapamycin作用36h,激活自噬后開始順鉑干預(yù);自噬抑制實(shí)驗(yàn):100μM Chloroquine作用48 h,100mM 3-methyladenosine作用24 h,抑制自噬后開始順鉑干預(yù)。在BRCA1不同表達(dá)水平的EOCSCs中調(diào)節(jié)自噬活性,通過CCK-8法檢測各組細(xì)胞的細(xì)胞活力和增殖活性;利用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞的細(xì)胞周期。最后利用Western Blot方法檢測各組EOCSCs中BRCA1、自噬調(diào)節(jié)蛋白、干細(xì)胞標(biāo)記蛋白和耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá)變化以及LC3-II/I比值變化。結(jié)果:1、BRCA1在人卵巢癌化療耐藥組織中表達(dá)顯著上調(diào);BECN1、ATG5、ATG7、ABCG2、ABCB1的mRNA水平在化療耐藥卵巢癌組織中明顯高于化療敏感卵巢癌組織,Beclin-1、ATG5、POU5F1、NANOG的蛋白表達(dá)水平在化療耐藥卵巢癌組織中明顯高于化療敏感卵巢癌組織,LC3-II/I比值明顯增高,ATG7表達(dá)增高不顯著,p62表達(dá)水平變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;卵巢癌組織中BRCA1與ABCG2基因表達(dá)水平存在正相關(guān)。2、通過無血清懸浮球方法能夠從人卵巢癌細(xì)胞系SKOV3中分離和富集EOCSCs,且與SKOV3細(xì)胞系相比EOCSCs擁有更強(qiáng)的細(xì)胞活力和增殖能力,高表達(dá)的干細(xì)胞相關(guān)因子CD44、CD133、POU5F1、NANOG,高表達(dá)的耐藥相關(guān)蛋白P-gp、ABCG2和更強(qiáng)的耐藥性,以及高表達(dá)的BRCA1和更高的自噬通量。3、以EOCSCs為工具細(xì)胞,過表達(dá)BRCA1顯著促進(jìn)了自噬的發(fā)生和發(fā)展,ATG5、Beclin-1蛋白水平明顯增高,ATG7變化不顯著,自噬流明顯增強(qiáng);過表達(dá)BRCA1能夠上調(diào)耐藥相關(guān)蛋白P-gp、ABCG2的表達(dá),對TP53-BP1的調(diào)節(jié)作用不明顯;隨著BRCA1表達(dá)和自噬水平的增高,干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記蛋白POU5F1和NANOG的表達(dá)明顯增高。在貼壁的SKOV3細(xì)胞中上調(diào)BRCA1后,干細(xì)胞相關(guān)表面標(biāo)記物CD44的表達(dá)有明顯增高。在順鉑作用下,過表達(dá)BRCA1能夠抑制EOCSCs的凋亡,敲低自噬調(diào)節(jié)基因BECN1和自噬相關(guān)基因ATG5能夠促進(jìn)凋亡。4、沉默BRCA1顯著降低了EOCSCs的細(xì)胞活力,細(xì)胞周期出現(xiàn)G2/M期阻滯;激活自噬后細(xì)胞活力出現(xiàn)明顯增加,G2/M期阻滯程度有所緩解;抑制自噬活性后,細(xì)胞活力出現(xiàn)明顯減弱,G2/M期阻滯程度增加,出現(xiàn)明顯凋亡峰。沉默BRCA1通過負(fù)性調(diào)節(jié)Beclin-1表達(dá),抑制LC3-I向LC3-II轉(zhuǎn)化,阻礙自噬發(fā)生發(fā)展進(jìn)程,進(jìn)而抑制P-gp表達(dá),降低EOCSCs耐藥性,同時(shí)對卵巢癌細(xì)胞的干細(xì)胞特性轉(zhuǎn)化起到負(fù)向調(diào)節(jié)作用;激活自噬后BRCA1表達(dá)降低。結(jié)論:1、BRCA1在化療耐藥的卵巢癌組織和EOCSCs中表達(dá),BRCA1呈高表達(dá),且化療耐藥的卵巢癌組織具有較高水平的基礎(chǔ)自噬。2、利用無血清懸浮球方法從人卵巢癌細(xì)胞系SKOV3中分離并富集EOCSCs,能夠表達(dá)多能干細(xì)胞表面標(biāo)記CD44、CD133和干細(xì)胞相關(guān)因子POU5F1、NANOG,且EOCSCs與親本細(xì)胞相比具有較高的細(xì)胞活力和增殖能力,較高的自噬水平及耐藥能力。3、BRCA1可以通過正向調(diào)節(jié)自噬的發(fā)生發(fā)展,增強(qiáng)EOCSCs的細(xì)胞活力和促進(jìn)增殖、抑制細(xì)胞凋亡、緩解細(xì)胞周期G2/M期阻滯、增強(qiáng)耐藥性以及促進(jìn)干細(xì)胞特性轉(zhuǎn)化。激活自噬能夠一定程度上降低BRCA1表達(dá),兩者存在相互調(diào)節(jié)作用。
【圖文】：

中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文.3 耐藥相關(guān)基因 ABCG2、ABCB1 在卵巢癌化療耐藥組織和敏感組的差異性表達(dá)為了驗(yàn)證卵巢癌樣本的耐藥性，在鉑類耐受和鉑類敏感性卵巢癌組織中通ealtime PCR 方法檢測 ABCG2 和 ABCB1 的 mRNA 水平。結(jié)果顯示，在耐藥組 ABCG2 和 ABCB1 的 mRNA 水平均高于敏感組織（圖 1.2）。

圖 1.3 BRCA1 與 ABCG2、ABCB1 在卵巢癌組織中的相關(guān)性研究A：漿液性卵巢癌組織中 ABCG2 水平與 BRCA1 水平的相關(guān)性；B：漿液性卵巢癌組織中ABCB1 水平與 BRCA1 水平的相關(guān)性。N=20。散點(diǎn)圖中的每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)獨(dú)立樣本的相對表達(dá)。3.5 自噬相關(guān)因子在卵巢癌化療耐藥組織和敏感組織中的差異性表達(dá)Realtime PCR 結(jié)果顯示 BECN1，ATG5 和 ATG7 的 mRNA 水平在耐藥組織中高于敏感組織（圖 1.4 A,E,G）。Western Blot 結(jié)果顯示 Beclin-1，，ATG5 和 LC3II/I 在耐藥組織中的表達(dá)顯著高于敏感組織（圖 1.4 B,F,D）。ATG7 的表達(dá)略有增加趨勢，自噬底物 p62 表達(dá)有下降的趨勢（圖 1.4 H,C），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這些結(jié)果表明 BRCA1 和自噬可能參與卵巢癌耐藥的發(fā)展和維持。3.6 干細(xì)胞相關(guān)因子 POU5F1 和 NANOG 在卵巢癌化療耐藥組織和敏
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R737.31

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 ;BRCA1基因變異致癌風(fēng)險(xiǎn)分析出爐[J];廣州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2018年05期

2 李萌輝;劉俊田;;BRCA1/2基因檢測在惡性腫瘤中的應(yīng)用[J];中國腫瘤臨床;2019年07期

3 郭文平;趙燁;;BRCA基因檢測相關(guān)卵巢癌的研究進(jìn)展[J];臨床醫(yī)藥文獻(xiàn)電子雜志;2017年55期

4 王寧;;BRCA2突變與兒童和青少年非霍奇金淋巴瘤風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[J];抗癌之窗;2019年04期

5 譚東明;尹紅英;;人肺腺癌A549細(xì)胞株BRCA1基因甲基化與肺癌治療耐藥的關(guān)系淺談[J];現(xiàn)代職業(yè)教育;2016年33期

6 石曦雯;羅衛(wèi)民;湯朗坤;;RSK4與BRCA1基因甲基化在乳腺癌發(fā)病機(jī)制中的作用探討[J];健康之路;2017年07期

7 Zi-Zhen Zhang;Yuan Jie Charles Liu;Xiao-Lu Yin;Ping Zhan;Yi Gu;Xing-Zhi Ni;;Loss of BRCA1 expression leads to worse survival in patients with gastric carcinoma[J];World Journal of Gastroenterology;2013年12期

8 ;Will Chinese ovarian cancer patients benefit from knowing the BRCA2 mutation status?[J];癌癥;2012年01期

9 ;Individualized Chemotherapy in Advanced NSCLC Patients Based on mRNA Levels of BRCA1 and RRM1[J];Chinese Journal of Cancer Research;2012年03期

10 TANAKA Kaoru;;BRCA1 involved in regulation of Bcl-2 expression and apoptosis susceptibility to ionizing radiation[J];Science China(Physics,Mechanics & Astronomy);2011年05期

相關(guān)會議論文 前10條

1 Mengwei Wang;Mingxiu Lv;Kui Lu;Guangbin Liu;Zhijie Sun;;Design and synthesis of active peptides based on BRCA1(782-786) and interaction of they with target peptide RAD51(181-200)[A];河南省化學(xué)會2018年學(xué)術(shù)年會摘要集[C];2018年

2 史庭燕;Pan WANG;Caixia XIE;Sheng YIN;Di SHI;Congchong WEI;Wenbin TANG;Rong JIANG;Xi CHENG;Qingyi WEI;Qing WANG;Rongyu ZANG;;BRCA1 and BRCA2 mutations in ovarian cancer patients from China:ethnic-related mutations in BRCA1 associated with an increased risk of ovarian cancer[A];2017中國長三角遺傳學(xué)大會會議手冊[C];2017年

3 李文鳳;胡震;張斌;曹明智;王永勝;沈鎮(zhèn)宙;邵志敏;;BRCA1 1100delAT突變:中國家族性乳腺癌人群中重復(fù)出現(xiàn)的突變[A];第四屆中國腫瘤學(xué)術(shù)大會暨第五屆海峽兩岸腫瘤學(xué)術(shù)會議教育集[C];2006年

4 Tatyana Grushko;Olufunmilayo I Olopade;;BRCA1 Promoter Hypermethylation is Associated with Expression and Copy Number of BRCA1 in Sporadic Breast Cancer[A];中國藥理學(xué)會化療藥理專業(yè)委員會第九屆學(xué)術(shù)研討會論文摘要集[C];2008年

5 Wang Ziyi;Yading Xie;Guoshuang Shen;Fangchao Zheng;Dengfeng Ren;Jiuda Zhao;;The Relationship between BRCA1/2 Mutations and the Efficacy of DNA-Damaging Drugs in Triple-Negative Breast Cancer:A Meta-analysis[A];第十二屆全國免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會摘要匯編[C];2017年

6 Nan Kang;Dan Li;Weimin Zhang;Qimin Zhan;;BRCA1 negatively regulates miR-146a and inhibits its tumor promoting functions in breast cancer cells[A];全國腫瘤流行病學(xué)和腫瘤病因?qū)W學(xué)術(shù)會議論文集[C];2015年

7 Carlota Costa;Jose Javier Sanchez;Ana Gimenez-Capitan;Teresa Moran;Susana Benlloch;Miquel Taron;Rafael Rosell;;BRCA1,RAP80 and SUMO ligases (PIAS1 and PIAS4) mRNA expression levels and survival in advanced gastric cancer patients receiving second-line docetaxel chemotherapy[A];2011醫(yī)學(xué)科學(xué)前沿論壇第十二屆全國腫瘤藥理與化療學(xué)術(shù)會議論文集[C];2011年

8 雷鈞艷;吳卉;馬靈霏;吳承容;郝晨宇;許玉琴;靳翠紅;;慢性鋁暴露對大鼠學(xué)習(xí)記憶及腦BRCA1水平影響的實(shí)驗(yàn)研究[A];中國毒理學(xué)會第九次全國毒理學(xué)大會論文集[C];2019年

9 史庭燕;Pan WANG;Wenbin TANG;Rong JIANG;Sheng YIN;Di SHI;Xi CHENG;Qing WANG;Qingyi WEI;Rongyu ZANG;;Correlation of residual disease and survival in germline BRCA mutationassociated ovarian cancer[A];2017中國長三角遺傳學(xué)大會會議手冊[C];2017年

10 ;The mechanism of BRCA1 participate sporadic breast carcinomas genesis[A];兩岸三地藥理學(xué)與臨床藥理學(xué)術(shù)會議論文集[C];2008年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 記者 靳澎;我國七成卵巢癌初診已為晚期[N];家庭醫(yī)生報(bào);2017年

2 南方日報(bào)記者 李R

本文編號：2700203