【摘要】：[研究目的]子宮內(nèi)膜癌(endometrial cancer)是僅次于宮頸癌的第二大女性生殖系統(tǒng)腫瘤,有逐年增高和年輕化的趨勢(shì)。蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5(PRMT5)是一種新興的表觀遺傳學(xué)酶,主要通過對(duì)組蛋白精氨酸殘基H4R3,H3R8和H2AR3的雙甲基化,調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄。本課題主要研究蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5(PRMT5)在I型子宮內(nèi)膜癌惡性進(jìn)展中的生物學(xué)作用及其作用機(jī)制,探討其表達(dá)與疾病進(jìn)展和不良預(yù)后的關(guān)系,為子宮內(nèi)膜癌尋找新的診斷標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)。[實(shí)驗(yàn)方法]1、研究病例標(biāo)本的選擇選取山東大學(xué)齊魯醫(yī)院病理科存檔的病例及蠟塊,包括子宮內(nèi)膜樣腺癌、子宮內(nèi)膜粘液腺癌、非典型增生和簡單/復(fù)雜增生子宮內(nèi)膜組織,并完善相關(guān)臨床病理資料。選取病例的所有切片都進(jìn)行重新的閱片和判讀。2、免疫組化及相關(guān)性分析通過免疫組化技術(shù)檢測(cè)PRMT5的表達(dá)在不同類型子宮內(nèi)膜癌組織和增生內(nèi)膜組織中有無區(qū)別,分析PRMT5的表達(dá)與EC臨床病理特點(diǎn)(年齡、組織學(xué)級(jí)別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等)之間的相關(guān)性,以及PRMT5表達(dá)與ERα表達(dá)的相關(guān)性。3、兩種細(xì)胞株中PRMT5的表達(dá)運(yùn)用免疫組織化學(xué)、WestemBlot和rt-qPCR技術(shù),從蛋白水平及mRNA水平比較高分化Ishikawa和中分化KLE兩種子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系中PRMT5的表達(dá)差異。4、細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染設(shè)計(jì)合成PRMT5 shRNA對(duì)ERαp陽性子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系Ishikawa進(jìn)行轉(zhuǎn)染,用RT-PCR和Western blot檢測(cè)PRMT5蛋白表達(dá)情況。評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染效率。5、檢驗(yàn)沉默PRMT5基因后子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞功能的變化①細(xì)胞增殖檢測(cè):CCK-8法檢測(cè)shRNA干擾PRMT5的表達(dá)后對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖能力的影響;②克隆/集落形成實(shí)驗(yàn):檢測(cè)PRMT5基因沉默后,腫瘤細(xì)胞空間克隆/集落形成能力的變化;③ 細(xì)胞侵襲、遷移能力分析:利用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PRMT5基因沉默后腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移能力的變化;④細(xì)胞凋亡檢測(cè):shRNA干擾PRMT5后,用AnnexinV-FITC凋亡試劑盒染色,流式細(xì)胞儀上檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡的變化;⑤細(xì)胞周期檢測(cè):shRNA干擾PRMT5后,用貝博周期試劑盒染色,流式細(xì)胞儀檢測(cè)對(duì)腫瘤細(xì)胞周期的影響。⑥運(yùn)用Western Blot和rt-qPCR技術(shù)尋找PRMT5的表達(dá)與增殖、凋亡相關(guān)的蛋白之間的相互作用6、探索沉默PRMT5對(duì)雌激素受體ERα表達(dá)的影響及機(jī)制利用shRNA敲低Ishikawa細(xì)胞系的PRMT5,與NC組相比,觀察雌激素受體ERα的表達(dá)變化,預(yù)測(cè)PRMT5的下游靶基因,并利用Western blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。7、檢驗(yàn)PRMT5與SRC-1及雌激素受體ERα的結(jié)合運(yùn)用co-ip實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證PRMT5與甾體激素受體輔助激活蛋白-1(SRC-1)、雌激素受體ERα的結(jié)合作用。8、探索E2對(duì)PRMT5的影響通過細(xì)胞系饑餓、梯度雌激素E2加藥培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)觀察E2對(duì)PRMT5表達(dá)是否有影響。[結(jié)論]1、PRMT5在子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中高表達(dá),著色以細(xì)胞漿為主,而在子宮內(nèi)膜粘液腺癌中低表達(dá)或失表達(dá)。在簡單增生、復(fù)雜增生、非典型增生、子宮內(nèi)膜樣腺癌陽性率依次升高,分別為39%、77%、90%和95%(P0.001,其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。其表達(dá)與腫瘤的分化程度相關(guān),在高、中分化子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)較高,在低分化子宮內(nèi)膜癌中失表達(dá);此外,PRMT5還與子宮內(nèi)膜樣腺癌的Ki-67增殖指數(shù)以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、ERα的表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)。2、沉默子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中的PRMT5基因,其增殖及克隆能力明顯降低、凋亡增多。腫瘤細(xì)胞遷移及侵襲能力明顯下降,表明PRMT5可以調(diào)控腫瘤的增殖和凋亡,從而影響其發(fā)生和發(fā)展。PRMT5可以通過上調(diào)c-Myc促進(jìn)細(xì)胞的增殖,上調(diào)Bcl-2,下調(diào)P53的表達(dá)水平對(duì)細(xì)胞凋亡起到抑制的作用。因此,針對(duì)PRMT5開發(fā)基因治療的藥物,有可能成為子宮內(nèi)膜癌抑制治療的新靶點(diǎn)。3、通過信號(hào)通路各蛋白表達(dá)的分析,在Ishikawa細(xì)胞系中沉默PRMT5的表達(dá)后,雌激素受體ERα表達(dá)量受抑制,PRMT5的對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖和調(diào)控可能是通過對(duì)雌激素受體ERα的調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)的,且PRMT5與甾體激素受體輔助激活蛋白-1(SRC-1)、雌激素受體ERca能形成復(fù)合物。4、通過梯度激素加藥實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)E2能抑制PRMT5表達(dá)。
【圖文】：

１．邋ＰＲＭＴ５在子宮內(nèi)膜樣腺癌中的表達(dá)明顯升高逡逑免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，ＰＲＭＴ５在子宮內(nèi)膜樣腺癌（ＥＥＣ）中表達(dá)陽性率最逡逑高，，而在Ｉ型子宮內(nèi)膜癌亞型ＭＥＣ邋（子宮內(nèi)膜癌粘液腺癌）中失表達(dá)。在２１例逡逑子宮內(nèi)膜粘液腺癌中，粘液部分表現(xiàn)為低表達(dá)或陰性，僅對(duì)于粘液腺癌伴部分子逡逑宮內(nèi)膜樣腺癌分化的混合病例中，子宮內(nèi)膜樣腺癌分化的部分有胞漿ＰＲＭＴ５高逡逑表達(dá)。ＰＲＭＴ５在３３例單純?cè)錾�、２２例�?fù)雜X椛ⅲ保崩塹湫馱鏨�、４２例子宫内辶x夏ぱ侔┲械難糶月室來紊擼直鷂常梗ュ澹ǎ保常常常�、ＡP罰ィǎ保罰玻玻�、９０％（１０／１１）辶x蝦停梗擔(dān)ィǎ矗埃矗玻╁澹ǎ校跡埃埃埃保鉅煬哂型臣蒲б庖澹�。Ｐ＿b停裕底櫓舊嵌ㄎ唬海矗插義俠庸諛ぱ侔┲�，３１例呈下汒浆Ｐ＿b停裕蹈弒澩錚估氏鄭校遙停裕檔牡捅澩錚義希怖跣員澩鎩Ｔ謐庸諛じ叢釉鏨保埃玻駁難糶圓±斜硐治桶斯餐義媳澩鎩＃常忱庸諛さゴ啃栽鏨±南傯逯杏校獨(dú)拾吮澩錚防∪隋義舷傯宀槐澩錚渲氏赴拾吮澩錚僨逋技鉸跡�、６、ＹEⅲ�、９、１０、１１）。辶x

本文編號(hào)：2699235