發(fā)布時(shí)間：2020-05-31 13:43

【摘要】：目的:通過(guò)分析FTO基因中rs79206939A/G、rs9930506A/G、rs8050136A/C和rs1588413C/T多態(tài)位點(diǎn)與多囊卵巢綜合征(PCOS)的相關(guān)性及對(duì)PCOS患者妊娠結(jié)局(IVF)的影響。同時(shí)檢測(cè)FTO、IRX3和IRX5蛋白在4種不同表型即PCOS肥胖、PCOS非肥胖、對(duì)照肥胖和對(duì)照非肥胖中的表達(dá)變化,探討FTO在PCOS中的可能作用。方法:本實(shí)驗(yàn)隨機(jī)選取2015年12月到2017年12月在南華星輝生殖健康醫(yī)院就診的不孕患者為研究對(duì)象,其中333例作為實(shí)驗(yàn)組,183例由于男方因素不孕而就診的女性為對(duì)照組。PCOS患者的確診及納入標(biāo)準(zhǔn)按照2003年的鹿特丹會(huì)議制定的原則實(shí)施。采集所有受試對(duì)象的靜脈血2 m L和臨床資料。本實(shí)驗(yàn)采用分子開(kāi)關(guān)(on-off switch)和限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)兩種經(jīng)典的方法對(duì)基因進(jìn)行分型。繼而統(tǒng)計(jì)不同基因型的出現(xiàn)頻率,然后分析其在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中有無(wú)差異。根據(jù)收集樣本的身體質(zhì)量指數(shù)(BMI)進(jìn)一步把樣本分為4組:PCOS肥胖(BMI"g25 kg/m2)、PCOS非肥胖、對(duì)照肥胖和對(duì)照非肥胖組。收集受試對(duì)象的卵泡液和顆粒細(xì)胞并提取其中蛋白,Western-Blot分析FTO、IRX3和IRX5這三種蛋白在四種不同表型中的表達(dá)情況。根據(jù)已分型的樣本,查閱醫(yī)院檔案資料,分析不同基因型的IVF結(jié)局的影響。結(jié)果:1.rs79206939A/G多態(tài)中AA、AG、GG在PCOS組中頻率分別為3.0%、23.1%、73.9%,與對(duì)照組中的3.3%、16.4%、80.3%相比p值為0.197,無(wú)顯著差異;AA+AG和GG在實(shí)驗(yàn)組的頻率分別為26.1%、73.9%,與對(duì)照組中的19.7%、80.3%相比p值為0.100,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;等位基因A和G在實(shí)驗(yàn)組中的頻率分別為14.6%和85.4%,與在對(duì)照組中的11.5%和88.5%相比p值為0.164,仍無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在臨床生化數(shù)據(jù)的分析中,無(wú)論是在實(shí)驗(yàn)組或是對(duì)照組,其指標(biāo)都無(wú)顯著差異。做IVF分析時(shí),PCOS大組中,AA+AG亞組的優(yōu)胚率和移植率均顯著高于GG亞組(p=0.020;0.018)。2.rs9930506A/G多態(tài)中GG、AG、AA在PCOS組中的頻率分別為1.2%、30.9%、67.9%,與對(duì)照組中的1.1%、27.3%、71.6%相比p值為0.682,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;隱性模型GG+AG和AA在實(shí)驗(yàn)組中的頻率分別為31.2%和68.8%,與對(duì)照組中的28.4%、71.6%相比p值為0.382,無(wú)顯著差異;等位基因G和A在實(shí)驗(yàn)組中的頻率分別為16.7%、83.3%,在對(duì)照組中頻率分別為14.8%、85.2%,分析得出p值為0.423,無(wú)顯著差異。在臨床生化數(shù)據(jù)的比較中,PCOS組中在GG+AG和AA兩個(gè)亞組中睪酮水平具有顯著差異(p=0.008),其他指標(biāo)均無(wú)顯著差異。在IVF分析中,PCOS組中的GG+AG和AA兩亞組中各個(gè)指標(biāo)也沒(méi)有顯著差異3.rs8050136A/C中AA、AC和CC在PCOS組中的頻率分別為1.5%、15.3%和83.2%,在對(duì)照組中頻率分別為1.0%、7.1%和91.9%,p值為0.009,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;AA+AC與CC在實(shí)驗(yàn)組中頻率分別為16.8%、83.2%,與對(duì)照組的8.2%、91.8%相比p值為0.007,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;等位基因A和C在實(shí)驗(yàn)組中頻率分別為9.2%、90.8%,與對(duì)照組的4.6%、95.4%相比p值為0.023,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在臨床生化數(shù)據(jù)的比較中,在PCOS組中AA+AC與CC組中,身體質(zhì)量指數(shù)(BMI)和卵泡刺激素(FSH)有顯著差異(p=0.030;0.006),其他指標(biāo)均無(wú)差異,且在對(duì)照組中,各個(gè)臨床指標(biāo)也均無(wú)差異。做IVF分析時(shí),只有排卵數(shù)在AA+AC組與CC組中有顯著差異(p=0.015),其余無(wú)顯著差異。4.rs1588413C/T多態(tài)中TT、CT、CC在PCOS組中的頻率分別為1.2%、46.8%、52.0%,在對(duì)照組中的頻率分別為1.6%、35.5%、62.9%,分析得出p值為0.045,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;隱性模型中TT+CT和CC組中的頻率分別為48.0%和52.0%,對(duì)應(yīng)在對(duì)照組中的頻率為37.2%和62.8%,分析得出p值為0.017,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;等位基因T和C在實(shí)驗(yàn)組中的頻率分別為24.6%和75.4%,對(duì)應(yīng)的在對(duì)照組中為19.4%和80.6%,p值為0.055,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在臨床生化數(shù)據(jù)的分析中發(fā)現(xiàn),PCOS組中的TT+CT亞組和CC亞組中的黃體生成素(LH)和雌二醇(E2)均有顯著差異(p=0.018;0.041),其他指標(biāo)均無(wú)顯著差異。做IVF分析時(shí),PCOS大組中,TT+CT亞組的移植率顯著高于CC亞組(p=0.024)。5.卵泡液中,FTO蛋白在肥胖樣本中的表達(dá)量顯著高于非肥胖表型的樣本,IRX3蛋白與FTO蛋白剛好相反,其在肥胖表型中的表達(dá)量顯著低于非肥胖表型的樣本。而IRX5蛋白表達(dá)量比較復(fù)雜,它在a(PCOS肥胖vs PCOS非肥胖)、b(對(duì)照肥胖vs對(duì)照非肥胖)、c(PCOS肥胖vs對(duì)照肥胖)、d(PCOS非肥胖vs對(duì)照非肥胖)四組中表達(dá)都顯示有差異,在a組比較中,肥胖亞組中的表達(dá)量顯著高于非肥胖亞組;而當(dāng)在b組做比較時(shí),肥胖亞組中的表達(dá)量卻又反過(guò)來(lái)顯著低于非肥胖亞組;在c組的比較中,明明PCOS肥胖組的表達(dá)量高;但是當(dāng)在d組做比較時(shí),對(duì)照非肥胖的表達(dá)量卻又增高了。6.卵巢顆粒細(xì)胞中,FTO蛋白在肥胖表型的樣本中表達(dá)量顯著高于非肥胖的樣本,當(dāng)在c組分析時(shí),在前者的表達(dá)量更高。IRX3蛋白和FTO蛋白的表達(dá)趨勢(shì)剛好相反,其在肥胖表型樣本的表達(dá)量顯著低于非肥胖表型的樣本;且在c組的比較中,PCOS肥胖組的表達(dá)量較低;在d組的比較中,PCOS非肥胖組的表達(dá)量較低。IRX5蛋白在無(wú)論是在肥胖還是非肥胖,PCOS組的表達(dá)量往往是顯著高于對(duì)照組。結(jié)論:1.FTO基因rs8050136A/C多態(tài)和rs1588413C/T多態(tài)與PCOS相關(guān)。2.FTO基因rs9930506A/G多態(tài)與PCOS患者睪酮水平相關(guān);rs8050136A/C多態(tài)與PCOS患者的BMI和FSH水平相關(guān);rs1588413C/T多態(tài)與PCOS患者的LH和E2水平相關(guān)。3.不管是在卵泡液還是在顆粒細(xì)胞中,FTO蛋白在肥胖表型中的表達(dá)量往往顯著高于非肥胖組,而IRX3恰恰相反,其在肥胖組中的表達(dá)量又往往顯著低于非肥胖組。IRX5的表達(dá)量受多因素的影響,它既受PCOS與否的影響也受肥胖與否的影響,且它在不同組織中如卵泡液和顆粒細(xì)胞表達(dá)不同。4.FTO基因rs79206939A/G多態(tài)與PCOS患者優(yōu)胚率和移植率有關(guān);rs8050136A/C多態(tài)與PCOS排卵數(shù)有關(guān);rs1588413C/T多態(tài)與PCOS患者的移植率相關(guān)。
【圖文】：

同的基因型：AA、AG 和 GG。根據(jù)實(shí)驗(yàn)原理，擴(kuò)增、電泳、BsaAⅠ酶切再電泳后曝光一條帶的為 AA 純合子，長(zhǎng)度為 294bp；電泳后曝光兩條帶的為 GG 純合子，長(zhǎng)度分別為 230bp 和 64bp；電泳后呈現(xiàn)出三個(gè)條帶的為 AG 雜合子，長(zhǎng)度分別為 294bp、230bp 和 64bp。(圖 4.5)

4.5 FTO 基因 rs8050136A/C 位點(diǎn)分析4.5.1 rs8050136A/C 多態(tài)性分析此位點(diǎn)采用 on-off switch 方法進(jìn)行分型，分型結(jié)果如圖 4.9 所示。經(jīng)過(guò)分型，rs8050136 呈現(xiàn)出三種基因型：AA、AC 和 CC。純合子 AA，，結(jié)束電泳后，會(huì)曝光出左關(guān)（無(wú)）右開(kāi)（有）的條帶現(xiàn)象；純合子 CC，經(jīng)過(guò)電泳后，會(huì)曝光出左開(kāi)（有）右關(guān)（無(wú)）的條帶現(xiàn)象；雜合子 AC，完成電泳后，會(huì)曝光出左開(kāi)（有）右開(kāi)（有）的條帶現(xiàn)象。由于在 PCR 過(guò)程中也會(huì)產(chǎn)生引物二聚體，故在每一個(gè)泳道的下方都會(huì)出現(xiàn)引物二聚體的成像。
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R711.75

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本文編號(hào)：2689944