【摘要】：目的本研究通過自發(fā)性早產(chǎn)動(dòng)物模型以及細(xì)胞實(shí)驗(yàn),探索在無菌性炎癥環(huán)境中,ADAMTS9基因表達(dá)與胎盤組織炎癥細(xì)胞浸潤程度及胎膜細(xì)胞凋亡的相關(guān)性,從而闡述ADAMTS9基因表達(dá)與自發(fā)性早產(chǎn)的可能聯(lián)系。方法動(dòng)物模型構(gòu)建(1)妊娠模型:8周齡C57BL/6小鼠,體重為19~21克,雌性36只隨機(jī)分為3組,12只/組,雄性12只隨機(jī)分為3組,4只/組;雌雄合籠,雌鼠出現(xiàn)陰道栓記為孕1天,3天后雌雄分離并將無陰道栓出現(xiàn)的雌鼠剔除。(2)無菌性炎癥模型:孕10天起,3組雌鼠均腹腔注射白介素-6(IL-6),1次/2日;(3)慢病毒感染模型:ADAMTS9慢病毒敲降體系購自吉?jiǎng)P生物(上海,中國),包括慢病毒及對(duì)照用空載體,選用磷酸鹽緩沖液(1×PBS)作為空白對(duì)照,在雌鼠孕1天、10天分別進(jìn)行尾靜脈注射,處理后3組小鼠分別為PBS空白對(duì)照組,空載體對(duì)照組及慢病毒敲降組。(4)早產(chǎn)模型:以小鼠出現(xiàn)陰道流血(陰道口有血漬)作為早產(chǎn)啟動(dòng)的判定標(biāo)準(zhǔn)(Romero),小鼠出現(xiàn)早產(chǎn)征象當(dāng)天斷頸處死,未出現(xiàn)則于孕19天處死;處死后取小鼠胎盤組織分為兩份,一份進(jìn)行QRT-PCR檢測(cè)ADAMTS9 mRNA含量以驗(yàn)證基因敲降的效果,一份石蠟包埋行HE染色觀察炎細(xì)胞浸潤情況,并通過免疫組化測(cè)ADAMTS9、TNF-α、IL-6蛋白表達(dá)情況。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)無菌性炎癥時(shí)體內(nèi)可能受累的靶細(xì)胞為胎膜細(xì)胞,因此選取人胎膜細(xì)胞系—WISH細(xì)胞系,進(jìn)行ADAMTS9慢病毒敲降體系轉(zhuǎn)染。處理后將細(xì)胞系分為敲降組、空白對(duì)照組以及空載體對(duì)照組,加入IL-6模擬炎癥環(huán)境培養(yǎng)24小時(shí)后,首先利用QRT-PCR及Western blot驗(yàn)證慢病毒敲降A(chǔ)DAMTS9基因的效率并測(cè)定Caspase-3 mRNA及蛋白表達(dá)量,最后流式分析檢測(cè)三組細(xì)胞的凋亡率并進(jìn)行比較。結(jié)果動(dòng)物實(shí)驗(yàn):(1)敲降小鼠體內(nèi)ADAMTS9基因后,小鼠早產(chǎn)率顯著降低(各組早產(chǎn)率:空白對(duì)照組90%,空載體對(duì)照組70%,敲降組22.2%)。(2)與空白對(duì)照組及空載體對(duì)照組相比,敲降組小鼠胎盤組織中ADAMTS9 mRNA水平及蛋白表達(dá)量降低并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。(3)三組小鼠胎盤組織中TNF-α、IL-6的表達(dá)均增加,說明無菌性炎癥形成。與空白對(duì)照組及空載體對(duì)照組相比,敲降組小鼠胎盤組織中ADAMTS9蛋白表達(dá)顯著降低。細(xì)胞實(shí)驗(yàn):(1)與空白對(duì)照組及空載體對(duì)照組相比,敲降組中ADAMTS9 mRNA水平及蛋白表達(dá)量顯著低于空白對(duì)照組及空載體對(duì)照組,說明慢病毒敲降體系顯著抑制了ADAMTS9基因表達(dá)。(2)敲降組細(xì)胞凋亡率(21.2%)顯著低于空白對(duì)照組(50.1%)及空載體對(duì)照組(52.9%),同時(shí),并且敲降組WISH細(xì)胞中細(xì)胞凋亡蛋白Caspase-3的表達(dá)顯著低于空白對(duì)照組及空載體對(duì)照組。結(jié)論無菌性炎癥條件下,抑制ADAMTS9基因表達(dá)可以降低妊娠小鼠早產(chǎn)率,其可能的作用機(jī)制為通過抑制胎膜細(xì)胞中ADAMTS9基因的表達(dá),降低胎膜細(xì)胞凋亡率,從而抑制早產(chǎn)臨產(chǎn)。因此未來有可能通過干預(yù)措施降低ADAMTS9表達(dá)從而降低早產(chǎn)的發(fā)生。
【圖文】：

降妊娠小鼠 ADAMTS9 基因可以顯著降低由無菌性炎癥引起的早產(chǎn)的過陰道栓判斷小鼠妊娠，發(fā)現(xiàn)空白對(duì)照組、空載體對(duì)照組、敲降組各0、9 只小鼠成功受孕。三組小鼠分別尾靜脈注射 PBS、慢病毒空載體。孕中期（孕 10 天）開始每天腹腔注射 IL-6（2×104U/kg），觀察小局。小鼠妊娠周期為 19~21 天，，繼續(xù)飼養(yǎng)至孕 18 天，發(fā)現(xiàn)空白對(duì)照組陰道口有血漬，為小鼠發(fā)生早產(chǎn)的征象，于小鼠孕 19 天斷頸法處死小剖結(jié)果，如圖 1。故空白對(duì)照組，空載體對(duì)照組，敲降組小鼠的早產(chǎn) 90%、70%、22.2%，說明敲降小鼠體內(nèi) ADAMTS9 基因后，當(dāng)小鼠無菌性炎癥時(shí)，小鼠早產(chǎn)率顯著降低。妊娠數(shù) 陰道流血數(shù) 胚胎發(fā)育數(shù) 早產(chǎn)率對(duì)照組 10 1 2 90%對(duì)照組 10 0 3 70%降組 9 0 7 22.2%

利用ABI 7500 Fast 進(jìn)行 QRT-PCR 檢測(cè) ADAMTS9 含量以驗(yàn)證基因敲降的效果（圖2），敲降組小鼠胎盤組織中 ADAMTS9 mRNA 表達(dá)量顯著小于空白對(duì)照組及空載體對(duì)照組（p＜0.05）。另一份制備石蠟切片，將三組石蠟切片行免疫組化測(cè)ADAMTS9 的表達(dá)量，在 10×10 倍鏡下觀察（圖 3），敲降組 ADAMTS9 的蛋白表達(dá)量顯著低于對(duì)照組。同理，測(cè)得三組胎盤組織中 TNF-α、IL-6 在 mRNA 水平及蛋白水平表達(dá)量均增加（圖 4-5），說明敲降 ADAMTS9 基因的小鼠模型構(gòu)建成功，且小鼠胎盤組織中形成無菌性炎癥。圖 2 三組小?
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R714.21

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2685825