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miR-3162-5p對(duì)人宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力的影響及其靶基因的初步研究

發(fā)布時(shí)間:2020-05-25 23:39
【摘要】:目的:探討miR-3162-5p對(duì)人宮頸癌(Cervical cancer,CC)SiHa細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響。生物信信息學(xué)預(yù)測(cè)miR-3162-5p的潛在靶基因,篩選靶基因富集的高分通路,初步分析驗(yàn)證RAS信號(hào)通路中miR-3162-5p的潛在靶基因。方法:構(gòu)建重組慢病毒miR-3162-5p模擬物(miR-3162-5p-LV)、miR-3162-5p模擬物空載組(LV-NC)、miR-3162-5p抑制物(miR-3162-5p-IN)、miR-3162-5p抑制物空載組(IN-NC),分別轉(zhuǎn)染宮頸癌SiHa細(xì)胞。采用CCK-8法對(duì)比轉(zhuǎn)染miR-3162-5p-LV、LV-NC及miR-3162-5p-IN、IN-NC后SiHa細(xì)胞增殖能力的區(qū)別;劃痕實(shí)驗(yàn)對(duì)比轉(zhuǎn)染miR-3162-5p-LV、LV-NC及miR-3162-5p-IN、IN-NC后SiHa細(xì)胞遷移能力區(qū)別;Transwell實(shí)驗(yàn)對(duì)比轉(zhuǎn)染miR-3162-5p-LV、LV-NC及miR-3162-5p-IN、IN-NC后SiHa細(xì)胞遷移、侵襲能力區(qū)別。檢索各microRNA數(shù)據(jù)庫如miRBase、miRWalk、miRTarBase等,運(yùn)用Targetscan在線生物軟件預(yù)測(cè)miR-3162-5p的可能靶基因。檢索多個(gè)信號(hào)通路網(wǎng)站如KEGG、STRING、COREMINE等,運(yùn)用生物信息軟件microRNA pathway分析通路閾值,選擇靶基因富集數(shù)目排名靠前的信號(hào)通路;運(yùn)用Oncomine網(wǎng)絡(luò)在線免費(fèi)芯片數(shù)據(jù)庫,查詢靶基因富集數(shù)目最多的信號(hào)通路上所有可以在KEGG上搜索到的基因在宮頸癌組織和非癌組織中的差異表達(dá)情況;利用STRING和Cytoscape構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)和從PPI中模塊分析;根據(jù)GEPIA在線數(shù)據(jù)庫關(guān)聯(lián)已有臨床分析,應(yīng)用GEPIA的相關(guān)Kaplan-Meier曲線逐個(gè)查詢關(guān)鍵基因在CC患者中總體生存率和無病生存率,篩選出有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的關(guān)鍵基因;根據(jù)生存分析結(jié)果,針對(duì)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義關(guān)鍵基因,運(yùn)用免疫組織化學(xué)S-P法初步驗(yàn)證這些基因在CC癌組織和非癌組織中的表達(dá)情況;RASA4是一個(gè)作用于RAS信號(hào)通路上GDP/GTP循環(huán)的RasGAP家族的一個(gè)分子,用Western blot驗(yàn)證轉(zhuǎn)染了miR-3162-5p-LV、LV-NC、miR-3162-5p-IN、IN-NC后SiHa細(xì)胞RASA4蛋白表達(dá)的區(qū)別。結(jié)果:轉(zhuǎn)染miR-3162-5p-LV后,宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞的增殖、遷移能力均增高;轉(zhuǎn)染miR-3162-5p-IN后,宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞的增殖、遷移能力有所下降;CCK-8法對(duì)比轉(zhuǎn)染miR-3162-5p-LV后SiHa細(xì)胞增殖能力增高(p0.05),轉(zhuǎn)染miR-3162-5p-IN后SiHa細(xì)胞增殖能力下降(p0.05);劃痕實(shí)驗(yàn)對(duì)比SiHa細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-3162-5p-LV后遷移能力增高(p0.05),轉(zhuǎn)染miR-3162-5p-IN后遷移能力下降(p0.05)。綜合各個(gè)microRNA pathway在線數(shù)據(jù)庫分析,得出miR-3162-5p靶基因富集于RAS信號(hào)通路的數(shù)目最多(34個(gè));在KEGG上查找RAS信號(hào)通路上的所有基因,隨后用Oncomine芯片數(shù)據(jù)庫篩選出RAS信號(hào)通路在宮頸癌組織和正常宮頸組織中存在差異表達(dá)的基因,其中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異表達(dá)基因77個(gè),包括31個(gè)高表達(dá)基因、42個(gè)低表達(dá)基因和4個(gè)在Oncomine芯片數(shù)據(jù)庫不同數(shù)據(jù)集中既存在高表達(dá)又存在低表達(dá)情況的差異基因;通過STRING和Cytoscape構(gòu)建的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)和模塊分析中得到RAS通路中在宮頸癌組織和非癌組織中差異表達(dá)的關(guān)鍵基因24個(gè)。關(guān)聯(lián)臨床上有關(guān)于24個(gè)關(guān)鍵基因的生存分析,結(jié)果顯示:FGFR2、GNG7、IGF1、GNB5、PTPN11和VEGFA突變的宮頸癌患者總體生存率較差,KITLG和PTPN11突變的宮頸癌患者無病生存率較差;免疫組織化學(xué)結(jié)果表示PTPN11在宮頸癌組織中存在高表達(dá)的趨勢(shì);Western blot實(shí)驗(yàn)顯示轉(zhuǎn)染miR-3162-5p-LV的SiHa細(xì)胞RASA4蛋白表達(dá)降低,轉(zhuǎn)染miR-3162-5p-IN的SiHa細(xì)胞ASA4蛋白表達(dá)升高。結(jié)論:miR-3162-5p對(duì)人宮頸癌SiHa細(xì)胞的增殖和遷移能力有促進(jìn)作用;miR-3162-5p調(diào)控RAS信號(hào)通路促進(jìn)宮頸癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移;PTPN11、RASA4可能是miR-3162-5p調(diào)控的RAS信號(hào)通路的靶基因,RASA4低表達(dá)、PTPN11高表達(dá)都有可能是miR-3162-5p調(diào)控RAS通路促進(jìn)CC發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移的其中機(jī)制。
【圖文】:

擴(kuò)增曲線,紫色,藍(lán)色,紅色


1(A)U6 的擴(kuò)增曲線,(B)miRNA-3162-5p-LV、LV-NC、miRNA-3162-5p-IN擴(kuò)增曲線,,黃色為 miRNA-3162-5p-LV 組、藍(lán)色為 LV-NC 組、紅色為 SiHa 組62-5p-IN、紫色為 IN-NC-1 (A)The amplification curves of U6,(B)the amplification curves of miRNA-3iRNA-3162-5p-LV、LV-NC and SiHa. Yellow for miRNA-3162-5p-LV, blue for LVn for miRNA-3162-5p-IN, purple for IN-NC

熒光顯微鏡,嘌呤霉素,細(xì)胞的,形態(tài)


2-3 miRNA-3162-5p 在各細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量,miR-3162-5p-LV 2-5p-IN、IN-NC 組和 SiHa 組相比,其 miR-3162-5p 表達(dá)量明顯高于.2-3 The relative expression of miRNA-3162-5p in each group. The3162-5p in miR-3162-5p-LV was significantly higher than that in LV-NC IN-NC group、SiHa group (P < 0.001) 熒光顯微鏡下 SiHa 細(xì)胞的形態(tài)1)熒光顯微鏡下未經(jīng)嘌呤霉素篩選的 SiHa 細(xì)胞的
【學(xué)位授予單位】:廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】:碩士
【學(xué)位授予年份】:2019
【分類號(hào)】:R737.33

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本文編號(hào):2680919

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