發(fā)布時(shí)間：2020-05-24 20:10

【摘要】：研究背景:卵巢癌是目前女性生殖系統(tǒng)腫瘤中發(fā)病率居于第三位但死亡率居首位的疾病,大約90%為上皮性卵巢癌(Epithelial ovarian cancer,EOC),其重要的臨床特征包括起病隱匿、易擴(kuò)散轉(zhuǎn)移、高耐藥性和高復(fù)發(fā),使婦女的生命健康受到嚴(yán)重的威脅。由于卵巢癌缺乏早期癥狀,大部分患者就診時(shí)處于腫瘤晚期,嚴(yán)重影響患者的生存率和生活質(zhì)量,目前為止卵巢癌的治療依舊是臨床的難題。因而,探尋卵巢癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和耐藥的發(fā)生機(jī)制,以及早期診療的新靶點(diǎn),是卵巢癌研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。腫瘤干細(xì)胞(Cancer stem cells,CSCs)是少數(shù)擁有自我更新能力的腫瘤細(xì)胞,具有易擴(kuò)散、高耐藥、高致瘤等特征。CSCs被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生發(fā)展、產(chǎn)生侵襲轉(zhuǎn)移以及復(fù)發(fā)耐藥的根本原因�；谝陨侠碚�,從卵巢癌干細(xì)胞的角度探討卵巢癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移以及復(fù)發(fā)耐藥的機(jī)制,是治療卵巢癌的新策略。Sohlh2(Spermatogenesis and oogenesis basic helix-loop-helix transcription factor2)是堿性螺旋-環(huán)-螺旋家族的重要成員,廣泛表達(dá)于正常人體組織,如卵巢、乳腺和結(jié)腸等。Sohlh2在多種腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)明顯低于相應(yīng)的正常組織。我們前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,卵巢癌組織中Sohlh2呈低表達(dá),并與腫瘤的分期和分級(jí)呈負(fù)相關(guān)。過表達(dá)Sohlh2可以通過下調(diào)cyclinD1、mmp9等基因的表達(dá),抑制卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲以及裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。上述結(jié)果提示,Sohlh2作為一個(gè)抑癌基因,參與卵巢癌發(fā)生發(fā)展的調(diào)控。Sohlh2是否參與卵巢癌干細(xì)胞增殖分化的調(diào)控,尚未見報(bào)道。Wnt/β-catenin信號(hào)通路的過度激活是導(dǎo)致卵巢癌發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要機(jī)制,已證實(shí),卵巢癌干細(xì)胞中激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路,可明顯促進(jìn)CSCs增殖。β-catenin分子是該信號(hào)通路的關(guān)鍵分子,被異常激活的調(diào)節(jié)因子通過各種方式最終引起胞質(zhì)中β-catenin增加,繼而導(dǎo)致β-catenin入核與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合,促進(jìn)下游靶基因C-myc、cyclinD1、MMP9等的表達(dá),在卵巢癌發(fā)生發(fā)展、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和耐藥中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。我們利用干細(xì)胞培養(yǎng)基富集卵巢癌干細(xì)胞,通過基因轉(zhuǎn)染、RNA干擾、FACS、RT-PCR、免疫熒光染色、Western Blot、裸鼠皮下移植瘤等實(shí)驗(yàn)技術(shù),探討Sohlh2在卵巢癌干細(xì)胞增殖分化中的作用以及對(duì)CSCs中Wnt/β-catenin信號(hào)通路的調(diào)控。研究方法:1.檢測(cè)Sohlh2對(duì)上皮性卵巢癌干細(xì)胞分化的影響(1)Sohlh2對(duì)上皮性卵巢癌細(xì)胞干性特征的影響體外培養(yǎng)卵巢癌細(xì)胞系HO8910和Skov3細(xì)胞,慢病毒轉(zhuǎn)染Sohlh2過表達(dá)和shRNA質(zhì)粒,建立穩(wěn)轉(zhuǎn)Sohlh2過表達(dá)或敲減卵巢癌細(xì)胞系。將HO8910細(xì)胞分為①Con組;②P-Sohlh2組;③CSCCon組;④CSCP-Sohlh2組四個(gè)組,將Skov3細(xì)胞分為①Si-Con組;②Si-Sohlh2組;③CSC Si-Con組;④CSC Si-Sohlh2組四個(gè)組,利用干細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)、FACS、順鉑耐藥實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Sohlh2對(duì)卵巢癌細(xì)胞干性特征的影響。(2)檢測(cè)Sohlh2對(duì)上皮性卵巢癌干細(xì)胞標(biāo)記蛋白表達(dá)的影響采用實(shí)時(shí)定量PCR、免疫熒光和Western Blot實(shí)驗(yàn),檢測(cè)HO8910四組細(xì)胞(Con,P-Sohlh2,CSC Con,CSC P-Sohlh2)和 Skov3 四組細(xì)胞(Si-Con,Si-Sohlh2,CSC Si-Con,CSC Si-Sohlh2)干細(xì)胞標(biāo)志物CD44、SOX2基因表達(dá)水平的變化。2.在體檢測(cè)Sohlh2對(duì)卵巢癌干細(xì)胞裸鼠皮下成瘤以及皮下腫瘤組織中卵巢癌干細(xì)胞的分化的影響通過裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn),在體檢測(cè)Sohlh2對(duì)卵巢癌干細(xì)胞分化的影響。將HO8910兩組細(xì)胞(CSC Con,CSC P-Sohlh2)分別注射到同一裸鼠皮下不同部位,定期觀察皮下腫瘤的生長(zhǎng)情況,記錄不同階段腫瘤團(tuán)塊的大小。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死裸鼠并取出腫瘤組織,稱瘤重。通過免疫組化染色和Western Blot實(shí)驗(yàn),檢測(cè)皮下腫瘤中CD44和SOX2表達(dá)狀況。3.探討Sohlh2影響卵巢癌干細(xì)胞分化的作用機(jī)制(1)通過 Western Blot 技術(shù),檢測(cè) HO8910 四組細(xì)胞(Con,P-Sohlh2,CSC Con,CSC P-Sohlh2)和 Skov3 四組細(xì)胞(Si-Con,Si-Sohlh2,CSC Si-Con,CSC Si-Sohlh2)中Wnt/β-catenin信號(hào)通路中β-catenin、C-myc、cyclinD1基因在蛋白水平的表達(dá)。(2)通過Western Blot和免疫組織化學(xué)檢測(cè)裸鼠皮下腫瘤組織中β-catenin、C-myc、cyclinDl基因在蛋白水平的表達(dá)。(3)通過Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)添加Wnt/β-catenin信號(hào)通路激動(dòng)劑(B4818)和阻斷劑(A8217)后C-myc、CD44、SOX2基因在蛋白水平的表達(dá)。4.檢測(cè)卵巢癌組織中Sohlh2、SOX2、β-catenin、C-myc的表達(dá)相關(guān)性利用卵巢癌組織芯片,通過免疫組織化學(xué)染色,分析卵巢癌組織中Sohlh2、SOX2、β-catenin、C-myc 表達(dá)的相關(guān)性。研究結(jié)果:1.(1)經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基誘導(dǎo)富集成球后,HO8910細(xì)胞CSCP-Sohlh2組干細(xì)胞球的數(shù)目和大小明顯小于CSC Con組;而Skov3細(xì)胞CSC Si-Sohlh2組組細(xì)胞球的數(shù)量和大小明顯大于CSC Si-Con組。FACS實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基誘導(dǎo)富集成球后,CSC P-Sohlh2組干細(xì)胞百分比明顯低于CSC Con組(p0.01)。耐藥實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在不同濃度順鉑作用48 h后,MTT結(jié)果顯示,HO8910細(xì)胞P-Sohlh2過表達(dá)組OD值明顯低于Con組(p0.05),Skov3細(xì)胞Si-Sohlh2組OD值明顯高于Si-Con組(p0.05)。(2)實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示,在HO8910細(xì)胞,與Con組細(xì)胞相比,P-Sohlh2組 CD44、SOX2、OCT4 的 mRNA 水平明顯降低;與 CSC Con 相比,CSC P-Sohlh2組CD44、SOX2、OCT4的mRNA水平也明顯降低;而在Skov3細(xì)胞中敲低Sohlh2后,Si-Sohlh2 組和 CSC Si-Sohlh2 組 CD44、SOX2、OCT4 的 mRNA 水平明顯高于相應(yīng)的對(duì)照組。免疫熒光染色結(jié)果顯示,在HO8910細(xì)胞,CSC P-Sohlh2組的CD44的熒光強(qiáng)度弱于CSC on組;在Skov3細(xì)胞,CSC Si-Sohlh2組熒光強(qiáng)度比C比C Si-Con組強(qiáng)。Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與Con組相比,P-Sohlh2組CD44、SOX2蛋白水平降低;與CSC Con相比,CSC P-Sohlh2組CD44、SOX2蛋白水平也降低。而敲減 Sohlh2 后,Si-Sohlh2 組和 CSCSi-Sohlh2 組 CD44、SOX2蛋白水平明顯高于相應(yīng)的對(duì)照組。2.裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,CSC P-Sohlh2組皮下腫瘤的生長(zhǎng)速度明顯慢于對(duì)照組;CSC P-Sohlh2組形成腫瘤的平均重量明顯低于CSC Con組。免疫組織化學(xué)染色和Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,腫瘤組織中CSC P-Sohlh2組CD44、SOX2的蛋白表達(dá)明顯降低。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,Sohlh2抑制在體卵巢癌干細(xì)胞的增殖,促進(jìn)其分化。3.免疫組織化學(xué)染色和Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在卵巢癌細(xì)胞和裸鼠皮下成瘤組織中,Sohlh2過表達(dá),下調(diào)了 Wnt/β-catenin信號(hào)通路的β-catenin及其靶基因C-myc、cyclinD1的蛋白表達(dá)。相反,Sohlh2敲低后,靶基因C-myc、cyclinD1的表達(dá)在蛋白水平顯著上調(diào)。體外培養(yǎng)的卵巢癌干細(xì)胞中添加Wnt/β-catenin信號(hào)通路激動(dòng)劑(B4818)或阻斷劑(A8217)作用24h后,Western Blot結(jié)果顯示,Wnt/β-catenin信號(hào)通路介導(dǎo)Sohlh2對(duì)C-myc、CD44、SOX2基因表達(dá)的調(diào)控。4.卵巢癌組織芯片免疫組化結(jié)果顯示,卵巢癌組織中Sohlh2的表達(dá)與SOX2、β-catenin和C-myc的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論:1、Sohlh2可促進(jìn)卵巢癌干細(xì)胞的分化。2、Sohlh2通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活發(fā)揮作用。
【圖文】：

為檢測(cè)Ｓｏｈｌｈ２對(duì)裸鼠皮下腫瘤組織中卵巢癌干細(xì)胞分化的作用，進(jìn)行了免逡逑疫組織化學(xué)染色和Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示Ｓｏｈｌｈ２過表達(dá)組ＣＤ４４、ＳＯＸ２逡逑的蛋白表達(dá)明顯低于Ｃｏｎ組（圖４）。逡逑３３逡逑

織中Ｓｏｈｌｈ２的表達(dá)較低時(shí)，Ｓ０Ｘ２的表達(dá)較高、ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ和Ｃ－ｍｙｃ的核內(nèi)表達(dá)逡逑也較高；反之，，Ｓｏｈｌｈ２表達(dá)較高時(shí)，Ｓ０Ｘ２的表達(dá)較低、卩－ｃａｔｅｎｉｎ和Ｃ－ｍｙｃ的核逡逑內(nèi)表達(dá)也較低（圖８）。逡逑Ｓｏｈｌｈ２邐ＳＯＸ邋２邐Ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ邐Ｃ－ｍｙｃ逡逑ｍ逡逑ｖ邐■，，邋－邐：１邐＾邋；邋－邋Ｖ，邋；；＜邋－逡逑圖８免疫組化結(jié)果顯示卵巢癌組織中Ｓｏｈｌｈ２與Ｓ０Ｘ２、（Ｊ－ｃａｔｅｎｉｎ、Ｃ－ｍｙｃ表達(dá)之逡逑間的相關(guān)關(guān)系逡逑３７逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R737.31

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 張文芳;Sohlh2通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移[D];山東大學(xué);2016年

本文編號(hào)：2678925