【摘要】：第一部分植入前遺傳學(xué)診斷在單基因病中的臨床應(yīng)用研究目的:本研究旨在探討多重置換擴(kuò)增(multiple displacement amplification,MDA)結(jié)合高通量測序(next generation sequencing,NGS)-單體型分析在單基因病植入前遺傳學(xué)診斷(preimplantation genetic diagnosis,PGD)中的應(yīng)用。材料與方法:采用MDA方法對活檢的單細(xì)胞進(jìn)行全基因組擴(kuò)增,以基因突變?yōu)槟繕?biāo)區(qū)域,在該突變上、下游選擇若干單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)作為遺傳標(biāo)記,通過NGS技術(shù)進(jìn)行植入前單體型分析(preimplantation halpotyping,PGH)和非整倍體篩查。所有胚胎單體型分析的結(jié)果經(jīng)Sanger測序驗(yàn)證。結(jié)果:14個患者家系包括11種單基因遺傳病,14名患者平均年齡31.7±5.5歲。通過控制性超促排卵(Control Ovarian Stimulation,COS)共獲卵193個,其中卵子成熟率為84.5%(163/193),受精率為83.4%(136/163),卵裂率為98.5%(134/136)。14個家系通過單體型預(yù)實(shí)驗(yàn)的有效SNP位點(diǎn)一共984個。共活檢72枚胚胎,經(jīng)胚胎單體型和染色體拷貝數(shù)檢測,正常胚胎比例為22.2%(16/72)。72枚胚胎中未獲診斷胚胎比例為6.9%(5/72),檢測的72枚胚胎中有4枚胚胎被檢測到發(fā)生了重組,所占比率為5.6%。所有胚胎單體型分析的結(jié)果經(jīng)Sanger測序驗(yàn)證,二者一致性為100%。14名患者有3例尚未移植,5例無可移植胚胎,6例已移植。移植的6例患者中一共4例獲得成功妊娠(先天性遺傳性耳聾、嬰兒神經(jīng)軸索營養(yǎng)不良、苯丙酮尿癥和腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良家系),有2例已成功足月分娩(先天性遺傳性耳聾、嬰兒神經(jīng)軸索營養(yǎng)不良家系),嬰兒均健康。另兩例繼續(xù)妊娠中。4名患者均為單胎妊娠。結(jié)論:MDA結(jié)合NGS-PGH方法可以幫助具有高遺傳風(fēng)險的單基因病家庭獲得健康后代,達(dá)到優(yōu)生優(yōu)育的目的。NGS-PGH可以同時進(jìn)行胚胎基因型和單體型的分析,是可信度高的PGH方法。第二部分嵌合體胚胎移植的價值及風(fēng)險探討目的:嵌合體胚胎是人類輔助生殖技術(shù)的早期胚胎中常見的現(xiàn)象,本研究將探討嵌合體胚胎的臨床價值。材料與方法:分析26對行PGD和PGS助孕移植夫婦(28個移植周期)移植嵌合體囊胚的染色體組成、臨床妊娠結(jié)局以及羊水穿刺結(jié)果;將患者捐贈的4枚嵌合體囊胚分成內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)外胚層部分應(yīng)用NGS方法再次分析。結(jié)果:28個移植嵌合體囊胚的PGD周期,臨床妊娠10例(35.7%),18例未孕。10例臨床妊娠中活產(chǎn)4例,嬰兒均健康,1例繼續(xù)妊娠中,5例發(fā)生早期流產(chǎn)。5例成功臨床妊娠的患者中,3例羊水核型結(jié)果正常,1例羊水核型結(jié)果為染色體平衡易位,1例未行羊水穿刺。NGS再次分析4枚嵌合體囊胚,有3枚囊胚滋養(yǎng)外胚層和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)診斷均正常,有1枚囊胚滋養(yǎng)外胚層診斷為正常,內(nèi)細(xì)胞團(tuán)診斷為嵌合體,染色體組成為:部分細(xì)胞7號染色體p21.3-p15.3區(qū)存在12.46Mb的缺失。結(jié)論:PGD和PGS周期中沒有正�？梢浦才咛r,可以嘗試移植嵌合體胚胎,但必須充分告知患者移植嵌合體胚胎可能存在的風(fēng)險,后續(xù)必須進(jìn)行有創(chuàng)的產(chǎn)前診斷。第三部分KDM5C基因突變致X-連鎖智力低下綜合征的分子機(jī)制研究目的:在體外轉(zhuǎn)錄和蛋白水平研究一智力低下綜合征家系KDM5C基因新發(fā)突變c.673del C的功能。材料與方法:構(gòu)建KDM5C基因野生型和突變型質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染人神經(jīng)元SH-SY5Y細(xì)胞系,熒光定量PCR(realtime fluorescence quantitative PCR,QPCR)和蛋白質(zhì)印跡(Western blot,WB)方法分別檢測轉(zhuǎn)染后KDM5C信使RNA(messenger RNA,m RNA)和KDM5C蛋白的表達(dá),流式細(xì)胞儀檢測SH-SY5Y細(xì)胞系組蛋白H3第4位賴氨酸(H3K4)三甲基化水平;同時利用si RNA瞬時轉(zhuǎn)染此細(xì)胞系,流式細(xì)胞儀檢測SH-SY5Y細(xì)胞系H3K4三甲基化水平。結(jié)果:與轉(zhuǎn)染野生型質(zhì)粒的SH-SY5Y細(xì)胞系相比,轉(zhuǎn)染突變型質(zhì)粒組細(xì)胞系KDM5C的m RNA和蛋白表達(dá)明顯減少,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。H3K4三甲基化水平在兩個轉(zhuǎn)染者之間比較無顯著性差異(P0.05);轉(zhuǎn)染si RNA組的SH-SY5Y細(xì)胞H3K4三甲基化水平與轉(zhuǎn)染陰性對照相比無顯著性差異(P0.05)。結(jié)論:KDM5C基因c.673del C突變降低了KDM5C的表達(dá),但并不影響SH-SY5Y細(xì)胞整體H3K4三甲基化水平;干擾KDM5C基因的表達(dá)不影響SH-SY5Y細(xì)胞整體H3K4三甲基化水平。
【圖文】：

胚胎培養(yǎng)和囊胚活檢，A：卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射（×200 倍C：卵裂期胚胎（×400 倍）；D：囊胚活檢（×400 倍）Embryo culture and blastocyst biopsy，A：intracytoplasmic sperm；C：cleavaged embryo；D：biopsied blastocyst8.2 活檢細(xì)胞收集和囊胚冷凍）提前吸 2 μL PBS 至 0.2 ml PCR 管中，將活檢的細(xì)胞暫離心。同時準(zhǔn)備空白對照，直接在 PCR 管中放入 2）活檢后胚胎行玻璃化冷凍保存�；顧z后胚胎置于平衡液 ES 中預(yù)平衡 5 min，然后移入玻胚胎從玻璃化液中移入冷凍載桿，套上外套管迅速放，冷凍載桿編號和胚胎編號一一對應(yīng)。8.3 多重置換擴(kuò)增）準(zhǔn)備 Buffer DLB：對 Buffer DLB 管進(jìn)行離心處理使

4）反應(yīng)結(jié)束后，電泳跑膠，目的片段長度區(qū)域測序。5）測序完成后，用 DNASTAR-Lasergene v6 分析結(jié)果4.10 胚胎解凍移植解凍 1 枚正常胚胎，B 超引導(dǎo)下移植入患者子宮。移植第 1430 天和 65 天囑患者分別做陰道超聲以確認(rèn)是否為臨床妊娠及功妊娠，妊娠 18 周行羊水穿刺驗(yàn)證 PGD 和 PGS 診斷結(jié)果。1 枚正常胚胎，直至妊娠。若正常胚胎解凍移植完，，均未妊娠是否愿意再次行 PGD 治療，讓患者自主選擇。圖 1-2 為解凍
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R714.8

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本文編號：2674402