【摘要】：妊娠期糖尿病(Gestational diabetes mellitus, GDM)是指在妊娠期首次發(fā)生或發(fā)現(xiàn)的糖尿病,妊娠期糖尿病在全世界尤其是在發(fā)展中國家的發(fā)病率正在逐年上升。GDM是威脅孕婦、胎兒健康的常見妊娠期并發(fā)癥之一,可導致孕婦能量代謝功能紊亂,從而發(fā)生巨大兒、羊水過多、自然流產、胎兒畸形、胎兒窘迫、死胎、死產、新生兒低血糖、新生兒低鈣血癥及高膽紅素血癥等,對母嬰危害較大。其發(fā)病機制至今尚不清楚,目前較一致的觀點為：GDM與2型糖尿病(T2DM)有著相似的發(fā)病基礎,即遺傳基因缺陷基礎上存在胰島素抵抗(insulin resistance, IR)和胰島素分泌功能相對不足,其中IR占主要位置。 脂肪組織是人體最重要的內分泌器官之一,合成和分泌多種脂肪因子,包括瘦素(leptin)、脂聯(lián)素(adiponectin)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α、白細胞介素6(interleukin6, IL-6)和新發(fā)現(xiàn)的抵抗素(resistin)、內酯素(visfatin)、apelin、脂類快速趨化因子(fasting-induced adipose factor, FIAF)、視黃醇結合蛋白4(retinol-binding protein4, RBP4)及趨化素(chemerin):等。Chemerin在人體的脂肪組織、腎上腺、肝臟、肺、胰腺、胎盤、卵巢、皮膚等都有表達,其中主要表達于白色脂肪組織、肝臟和肺,參與炎癥反應、調節(jié)糖脂代謝等。其表達水平與肥胖相關,并有調節(jié)脂肪細胞的分化、脂解,促進脂肪細胞內胰島素信號傳導途徑等生物學效應。 作為新近被認識的脂肪因子Chemerin在肥胖、胰島素拮抗、代謝綜合征和2型糖尿病的發(fā)生、發(fā)展中所起的作用引起了越來越多的關注和越來越深入的研究。但正因為其新近被發(fā)現(xiàn)而且存在著人種等差異,目前對于它的認識還很不全面,許多問題尚待闡明。如Chemerin基因單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism, SNP)的分布及與脂肪組織中Chemerin mRNA轉錄與蛋白水平的表達和血漿濃度之間存在的內在關聯(lián)程度；以及與肥胖、胰島素拮抗和糖代謝異常病變程度上的相關性均未被揭示。 妊娠期糖尿病往往結合了肥胖、胰島素拮抗和糖代謝異常,但是Chemerin與妊娠期糖尿病的相關研究極少。本研究擬從整體水平探討妊娠期糖尿病外周血和臍帶血Chemerin的變化以及與代謝指標的關系；從細胞水平和分子水平探討妊娠期糖尿病的脂肪細胞和胎盤組織Chemerin mRNA和蛋白表達；同時采用基因擴增后直接測序法分析妊娠期糖尿病患者Chemerin SNPs的變化和分布；進一步闡明Chemerin SNPs與妊娠期糖尿病臨床指標的關系。從而深入研究妊娠期糖尿病的發(fā)病機制,為篩選有價值的疾病標志物及治療靶點提供依據(jù),完善妊娠期糖尿病的預測和診斷方法,以期為改善妊娠期糖尿病圍產結局提供新途徑。 第一部分妊娠期糖尿病患者Chemerin的變化及其臨床意義 研究目的： 分別測定GDM組和正常對照組孕婦外周血和臍血Chemerin的變化及其與BMI、血糖、血脂等指標的相關性,探討Chemerin與GDM的關系。 方法： 選取2012年1月到2012年10月在浙江大學醫(yī)學院附屬婦產科醫(yī)院產科門診定期產檢并住院待產的孕婦,參照2011年ADA診斷標準于孕24～28周診斷為GDM46例為GDM組,同期選取年齡、孕周、孕前體重指數(shù)等指標與GDM組相匹配的孕婦43例作為正常對照組,所有入選病例均于37-40周分娩。入院后由專人詳細記錄孕婦年齡、身高、孕前體重以及孕期體重增加量；同時分別測定兩組分娩前空腹血糖(Fast Plasm Glucose, FPG)、空腹胰島素(Fast Insulins,Fins)、糖化血紅蛋白(HemoglobinAlc, HbAlc)、總膽固醇(Total Cholesterole,TC)、甘油三酯(Triglyceride,TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)及低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C),并計算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)、孕前BMI、分娩時BMI。新生兒娩出斷臍后,立即用一次性無菌注射器從臍帶胎盤端抽取靜脈臍血l0ml。用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測定外周血及臍血Chemerin值；同時測量新生兒的體重(kg)和身長(Ht),計算BMI。 結果： 1.臨床資料比較：兩組孕婦的年齡、孕周、產次、孕次、孕前BMI差異無統(tǒng)計學意義(P均0.05)。GDM組孕期體重增加及分娩時BMI明顯高于正常對照組(P均0.05)。 2.兩組血糖、血脂、炎癥指標、胰島素和Chemerin的比較：GDM組外周血Chemerin水平顯著高于正常對照組(P0.05)；同時,FPG、Fins、TG、HbAlc及HOMA-IR、CRP、WBC均高于正常對照組(P均0.05)；而兩組的TC、HDL、LDL水平差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。 3.外周血Chemerin與各項指標的相關性分析：正常對照組Chemerin與FPG和HOMA-IR以及TG均負相關(r分別為-0.582,-0.376,-0.427,P分別為0.000,0.016,0.008)；而GDM組Chemerin與上述指標之間無相關性,但是與孕期體重增加量和分娩時BMI呈正相關(r分別為0.336、0.340,P分別為0.026,0.022)。 4.兩組臍帶血Chemerin水平和新生兒體質量比較：GDM組臍帶血Chemerin水平顯著高于對照組,分別為22.50±4.36pg/ml和19.85±6.06pg/ml,差異有顯著性(P0.05)；GDM組新生兒體重、BMI分別與正常對照組比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P均0.05)。 5.兩組外周血和臍血中Chemerin水平的比較：GDM組外周血、臍血Chemerin水平均顯著高于正常對照組相應測定值(P分別為0.001、0.026)；GDM組和正常對照組的臍血Chemerin水平顯著高于同組外周血中的水平(P分別為0.005、0.029)。 結論： (1)正常對照組外周血Chemerin水平與血糖、血脂代謝指標相關,提示Chemerin參與正常妊娠期能量代謝調節(jié),保持妊娠期血糖、血脂水平穩(wěn)定。 (2)GDM組外周血Chemerin水平明顯高于正常對照組,而且與孕期體重增加和分娩時BMI相關,但是與代謝指標無相關性。提示GDM組孕期體重增加過多導致Chemerin功能失衡,可能與GDM能量代謝異常有關。 (3)GDM組新生兒出生體重和臍帶血Chemerin水平均較正常對照組明顯增加,推斷Chemerin與GDM子代的并發(fā)癥有關。 第二部分妊娠期糖尿病患者脂肪和胎盤Chemerin mRNA以及蛋白表達的變化 研究目的： 分別檢測GDM組和正常對照組脂肪和胎盤組織中Chemerin mRNA以及蛋白表達的變化,探討Chemerin在妊娠期脂肪和胎盤組織中的分布情況以及與GDM的關系。 方法： 選取2012年1月到2012年10月在浙江大學醫(yī)學院附屬婦產科醫(yī)院產科門診定期產檢并住院待產的孕婦,參照2011年ADA診斷標準于孕24～28周診斷為GDM46例為GDM組,同期選取年齡、孕周、孕前體重指數(shù)等指標與實驗組相匹配的孕婦43例為正常對照組,所有入選病例均于37-40周分娩。擇期剖腹產手術時采集產婦下腹部皮下脂肪約5g；胎盤娩出后留取臍帶根部胎盤組織lcm x lcm x lcm,所有組織均液氮保存。通過熒光定量PCR檢測GDM組和正常對照組脂肪及胎盤組織中Chemerin mRNA表達；通過Westernblot檢測兩組脂肪和胎盤組織中Chemerin蛋白表達。結果： 1.總RNA提取的質量檢測：通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性。紫外燈下可見28s,18s,5s三條rRNA的條帶清晰,28s條帶的強度高于18s將近2倍,18s條帶的強度又高于5s,表明RNA質量良好。 2.實時熒光定量PCR擴增(SYBRGreenI熒光定量PCR相對定量法)。 2.1擴增曲線： 通過PCR儀自動生成的擴增曲線可以看到目的基因Chemerin以及內參基因Actin擴增曲線的線條圓滑,跨度大體一致,提示基因的擴增表達情況良好。 2.2兩組脂肪和胎盤組織Chemerin mRNA表達比較： GDM組脂肪組織和胎盤組織Chemerin mRNA平均表達量均高于正常對照組。差異具有顯著性(P0.01)。 3.兩組脂肪和胎盤組織Chemerin蛋白表達比較：經過灰度分析統(tǒng)計,GDM組脂肪和胎盤Chemerin/GAPDH均值均明顯高于正常對照組,差異具有顯著性(P0.01)。 結論： (1) Chemerin在妊娠期脂肪和胎盤組織中均有表達,參與正常妊娠生理代謝過程。 (2)GDM組脂肪組織和胎盤Chemerin mRNA和蛋白表達量均高于正常對照組,提示脂肪源性和胎盤源性的Chemerin參與GDM的發(fā)生發(fā)展。 第三部分妊娠期糖尿病患者Chemerin基因的單核苷酸多態(tài)性分析 研究目的 采用基因擴增后直接測序法分析妊娠期糖尿病患者Chemerin SNPs的變化和分布；進一步闡明Chemerin SNPs與妊娠期糖尿病臨床指標的關系。 方法： 選取2012年1月到2013年10月在浙江大學醫(yī)學院附屬婦產科醫(yī)院產科門診定期產檢并住院分娩的孕婦,參照2011年ADA診斷標準于孕24～28周診斷為GDM330例為實驗組；同期選取年齡、孕周、孕前體重指數(shù)等指標與實驗組相匹配的孕婦329例作為正常對照組,所有入選病例均于37-40周在本院分娩。各受試者進行空腹血糖、甘油三酯等生化指標的檢測�；谖墨I、NCBI及生物信息學軟件,篩查到rs3735170、rs6970196、rs10244748、rs17173608、rs1804764、rs3210475、 rs10278590(rs4721)、rs3735168、rs9942696、rs17835937十個位點。提取所有受試者基因組DNA,用直接測序法分析上述位點基因型,并進行相關分析。 結果 1.研究對象的臨床特征：兩組實驗對象的年齡、孕周、孕前BMI、SBP、DBP、 TC、HDL-C、LDL-C、Cr、BUN、ALT、GOT均沒有顯著性差異(P均0.05)；兩組FPG、TG、WBC、CRP、HOMA-IR、Fins均有顯著性差異(P均0.05)。 2.測序：各SNP位點測序結果均與探針法分型結果完全一致。 3.基因型和等位基因頻率分析 3.1HWE檢驗： 經Hardy-Weinberg檢驗分析,7個位點的P值均遠遠大于界值0.05,所研究的7個SNPs位點上觀察值與期望值相吻合,各基因頻率達到遺傳平衡,研究資料具有群體代表性,證明它們符合Hardy-Weinberg平衡。 3.2各SNP位點病例對照研究 rs3735170位點的C等位基因頻率在孕婦GDM病例組中為13.5%,正常對照組中為33.4%,C等位基因為GDM的保護因素(P=0.038),OR為0.303(0.103-0.886)；T等位基因頻率在GDM組為86.5%,正常對照組為66.6%,攜帶C的基因型CC+CT vsTT在GDM組中的分布頻率亦降低,P值為0.027,達到統(tǒng)計學意義。 rs17173608的C等位基因頻率在GDM組為1.7%,正常對照組為13.3%,C等位基因為GDM的保護因素(P=0.039),OR為0.132(0.015-1.177)；A等位基因頻率在GDM組為98.3%,在正常對照組為86.7%,攜帶C的基因型CC+CA vs AA在GDM組中的分布頻率亦降低,P值為0.039,達到統(tǒng)計學意義。 rs9942696的T等位基因頻率在GDM組為25.2%,正常對照組為16.3%,T等位基因為GDM的高危因素,OR為3.354(1.062-10.590)；C等位基因頻率在GDM組為74.8%,在正常對照組為83.7%,攜帶T的基因型TT+TC vs CC在GDM組中的分布頻率升高,P值為0.035,達到統(tǒng)計學意義。 其余SNP位點的等位基因及攜帶的相關基因型在兩組間未見統(tǒng)計學差異。 3.3LD檢驗： 沒有位點在同一個LD block內,未發(fā)現(xiàn)有與GDM發(fā)生相關的單倍體型。 4.各基因型間臨床及生化指標比較：rs17173608和rs9942696位點各基因型之間未見有統(tǒng)計學差異指標；rs3735170位點在孕期體重增加、FPG、TC、LDL指標中存在基因型組間顯著性差異。 結論 Chemerin rs3735170(TC)的不同基因型與GDM的發(fā)生存在著一定的聯(lián)系。
【圖文】：

糖尿病中的作用受到國內外學者的廣泛關注，但是具體作用機制還不清楚。根據(jù)脂肪細胞因子發(fā)現(xiàn)順序（如圖1 ) , Chemerin是最近發(fā)現(xiàn)的脂肪細胞因子。2007年Bozaoglu_等用信號序列捕獲技術首次確定Chemerin是一種脂肪細胞因子，由Chemerin基因（CHEMERIN基因）編碼，其編碼基因全長3289bp,位于染色體7q36.1,由6個外顯子和5個內含子組成。Chemerin有3種受體：Chemerin樣受體1(CMKLR 1)、肥大細胞表面趨化因子受體2(CCRL2)以及GPcRs家族成員GPRl[i'IChemerin主要通過自分泌或旁分泌途徑作用于CMKLR1受體而實現(xiàn)其生物學功能，如參與炎癥反應、調節(jié)糖脂代謝等。其表達水平與肥胖相關，并有調節(jié)脂肪細胞的分化、脂解，促進脂肪細胞內姨島素信號傳導途徑等生物學效應。IL-6 LEPTIN PAM AGT ZAG OmentinPTq jg PJ JUT]r^——— —1992 1993 1994 1^5 ia?7 1C?$ 咖 1 2034 2005 2C06 ￡007T7'0F-ct Adipc'rieclin SAA Chemerin【iT?9 (4) jeiR&P4c,iijV-eis pin p.kpjVlsfatin圖1脂肪細胞因子發(fā)現(xiàn)順序Chemerin具有促進脂肪細胞分化功能。Goralski等[丨2]，11011等[】3]，Takahashi等[14】研究報遒，人前脂肪細胞和成纖維細胞(3T3-L1)向脂肪細胞分化的過程中

圖2 GDM與正常對照組臨床資料的比較（f±s)組血糖、血脂、炎癥指標、胰島素、外周血ChemerinDM組外周血Chemerin水平顯著高于正常對照組（分別為20.11±363±3.63pg/ml, P=0.001 )；同時，F(xiàn)PG、Fins、TG、HbAlc 及 HOWBC 均高于正常對照組（分別為 6.07±1.74mmol/L, 13.50±2..33mmol/L, 6.10±1.90%, 3.40±1.51，5.04士1.96mg/L, 8.71±1.87 ( x.91mmol/L, 11.63±4.31 mu/L, 3.19±0.96mmol/L, 5.20士0.90%，2.1.17mg/L，，7.85±1.55 ( xlO^/L )，P 均<0.05 );而兩組間 TC、HDL、無統(tǒng)計學意義（P均>0.05),見表2,圖3，表3，圖4。
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R714.256

【參考文獻】

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1 劉妍,吳連方;妊娠期糖尿病孕婦的脂代謝變化[J];中國婦產科臨床;2002年03期

2 易曉芳;;疤痕子宮剖宮產術中出血的因素與預防[J];航空航天醫(yī)藥;2010年03期

3 余敏敏;韓國榮;王根菊;;妊娠合并重型肝炎40例臨床分析[J];實用婦產科雜志;2008年07期

4 上海市多胎妊娠調查協(xié)作組;10年多胎妊娠的變化[J];上海醫(yī)學;2004年03期

5 張瑩;王倩;侯為開;張莉;徐華;朱蕾;于珊;劉騫;黃慶先;;2型糖尿病患者chemerin水平變化與下肢血管病變的相關性[J];山東大學學報(醫(yī)學版);2011年08期

6 喬曉林,崔雪,陳玉琴;流動人口的圍產保健現(xiàn)狀[J];中國婦幼保健;2005年07期

7 隗洪進,隗伏冰,葉玲;再次剖宮產術中出血的臨床分析[J];中國實用婦科與產科雜志;2003年07期

8 柴珂;楊玲竹;;剖宮產術后再次妊娠84例分娩方式分析[J];中國實用婦科與產科雜志;2009年02期

9 蔣佩茹;邱申熊;;妊娠期肝病2137例臨床分析[J];肝臟;2006年04期

本文編號：2669147