【摘要】：妊娠期糖尿病(Gestational diabetes mellitus, GDM)是指在妊娠期首次發(fā)生或發(fā)現(xiàn)的糖尿病,妊娠期糖尿病在全世界尤其是在發(fā)展中國(guó)家的發(fā)病率正在逐年上升。GDM是威脅孕婦、胎兒健康的常見(jiàn)妊娠期并發(fā)癥之一,可導(dǎo)致孕婦能量代謝功能紊亂,從而發(fā)生巨大兒、羊水過(guò)多、自然流產(chǎn)、胎兒畸形、胎兒窘迫、死胎、死產(chǎn)、新生兒低血糖、新生兒低鈣血癥及高膽紅素血癥等,對(duì)母嬰危害較大。其發(fā)病機(jī)制至今尚不清楚,目前較一致的觀點(diǎn)為：GDM與2型糖尿病(T2DM)有著相似的發(fā)病基礎(chǔ),即遺傳基因缺陷基礎(chǔ)上存在胰島素抵抗(insulin resistance, IR)和胰島素分泌功能相對(duì)不足,其中IR占主要位置。 脂肪組織是人體最重要的內(nèi)分泌器官之一,合成和分泌多種脂肪因子,包括瘦素(leptin)、脂聯(lián)素(adiponectin)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α、白細(xì)胞介素6(interleukin6, IL-6)和新發(fā)現(xiàn)的抵抗素(resistin)、內(nèi)酯素(visfatin)、apelin、脂類快速趨化因子(fasting-induced adipose factor, FIAF)、視黃醇結(jié)合蛋白4(retinol-binding protein4, RBP4)及趨化素(chemerin):等。Chemerin在人體的脂肪組織、腎上腺、肝臟、肺、胰腺、胎盤、卵巢、皮膚等都有表達(dá),其中主要表達(dá)于白色脂肪組織、肝臟和肺,參與炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)糖脂代謝等。其表達(dá)水平與肥胖相關(guān),并有調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞的分化、脂解,促進(jìn)脂肪細(xì)胞內(nèi)胰島素信號(hào)傳導(dǎo)途徑等生物學(xué)效應(yīng)。 作為新近被認(rèn)識(shí)的脂肪因子Chemerin在肥胖、胰島素拮抗、代謝綜合征和2型糖尿病的發(fā)生、發(fā)展中所起的作用引起了越來(lái)越多的關(guān)注和越來(lái)越深入的研究。但正因?yàn)槠湫陆话l(fā)現(xiàn)而且存在著人種等差異,目前對(duì)于它的認(rèn)識(shí)還很不全面,許多問(wèn)題尚待闡明。如Chemerin基因單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism, SNP)的分布及與脂肪組織中Chemerin mRNA轉(zhuǎn)錄與蛋白水平的表達(dá)和血漿濃度之間存在的內(nèi)在關(guān)聯(lián)程度；以及與肥胖、胰島素拮抗和糖代謝異常病變程度上的相關(guān)性均未被揭示。 妊娠期糖尿病往往結(jié)合了肥胖、胰島素拮抗和糖代謝異常,但是Chemerin與妊娠期糖尿病的相關(guān)研究極少。本研究擬從整體水平探討妊娠期糖尿病外周血和臍帶血Chemerin的變化以及與代謝指標(biāo)的關(guān)系；從細(xì)胞水平和分子水平探討妊娠期糖尿病的脂肪細(xì)胞和胎盤組織Chemerin mRNA和蛋白表達(dá)；同時(shí)采用基因擴(kuò)增后直接測(cè)序法分析妊娠期糖尿病患者Chemerin SNPs的變化和分布；進(jìn)一步闡明Chemerin SNPs與妊娠期糖尿病臨床指標(biāo)的關(guān)系。從而深入研究妊娠期糖尿病的發(fā)病機(jī)制,為篩選有價(jià)值的疾病標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)提供依據(jù),完善妊娠期糖尿病的預(yù)測(cè)和診斷方法,以期為改善妊娠期糖尿病圍產(chǎn)結(jié)局提供新途徑。 第一部分妊娠期糖尿病患者Chemerin的變化及其臨床意義 研究目的： 分別測(cè)定GDM組和正常對(duì)照組孕婦外周血和臍血Chemerin的變化及其與BMI、血糖、血脂等指標(biāo)的相關(guān)性,探討Chemerin與GDM的關(guān)系。 方法： 選取2012年1月到2012年10月在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院產(chǎn)科門診定期產(chǎn)檢并住院待產(chǎn)的孕婦,參照2011年ADA診斷標(biāo)準(zhǔn)于孕24～28周診斷為GDM46例為GDM組,同期選取年齡、孕周、孕前體重指數(shù)等指標(biāo)與GDM組相匹配的孕婦43例作為正常對(duì)照組,所有入選病例均于37-40周分娩。入院后由專人詳細(xì)記錄孕婦年齡、身高、孕前體重以及孕期體重增加量；同時(shí)分別測(cè)定兩組分娩前空腹血糖(Fast Plasm Glucose, FPG)、空腹胰島素(Fast Insulins,Fins)、糖化血紅蛋白(HemoglobinAlc, HbAlc)、總膽固醇(Total Cholesterole,TC)、甘油三酯(Triglyceride,TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)及低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C),并計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)、孕前BMI、分娩時(shí)BMI。新生兒娩出斷臍后,立即用一次性無(wú)菌注射器從臍帶胎盤端抽取靜脈臍血l0ml。用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測(cè)定外周血及臍血Chemerin值；同時(shí)測(cè)量新生兒的體重(kg)和身長(zhǎng)(Ht),計(jì)算BMI。 結(jié)果： 1.臨床資料比較：兩組孕婦的年齡、孕周、產(chǎn)次、孕次、孕前BMI差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均0.05)。GDM組孕期體重增加及分娩時(shí)BMI明顯高于正常對(duì)照組(P均0.05)。 2.兩組血糖、血脂、炎癥指標(biāo)、胰島素和Chemerin的比較：GDM組外周血Chemerin水平顯著高于正常對(duì)照組(P0.05)；同時(shí),FPG、Fins、TG、HbAlc及HOMA-IR、CRP、WBC均高于正常對(duì)照組(P均0.05)；而兩組的TC、HDL、LDL水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 3.外周血Chemerin與各項(xiàng)指標(biāo)的相關(guān)性分析：正常對(duì)照組Chemerin與FPG和HOMA-IR以及TG均負(fù)相關(guān)(r分別為-0.582,-0.376,-0.427,P分別為0.000,0.016,0.008)；而GDM組Chemerin與上述指標(biāo)之間無(wú)相關(guān)性,但是與孕期體重增加量和分娩時(shí)BMI呈正相關(guān)(r分別為0.336、0.340,P分別為0.026,0.022)。 4.兩組臍帶血Chemerin水平和新生兒體質(zhì)量比較：GDM組臍帶血Chemerin水平顯著高于對(duì)照組,分別為22.50±4.36pg/ml和19.85±6.06pg/ml,差異有顯著性(P0.05)；GDM組新生兒體重、BMI分別與正常對(duì)照組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均0.05)。 5.兩組外周血和臍血中Chemerin水平的比較：GDM組外周血、臍血Chemerin水平均顯著高于正常對(duì)照組相應(yīng)測(cè)定值(P分別為0.001、0.026)；GDM組和正常對(duì)照組的臍血Chemerin水平顯著高于同組外周血中的水平(P分別為0.005、0.029)。 結(jié)論： (1)正常對(duì)照組外周血Chemerin水平與血糖、血脂代謝指標(biāo)相關(guān),提示Chemerin參與正常妊娠期能量代謝調(diào)節(jié),保持妊娠期血糖、血脂水平穩(wěn)定。 (2)GDM組外周血Chemerin水平明顯高于正常對(duì)照組,而且與孕期體重增加和分娩時(shí)BMI相關(guān),但是與代謝指標(biāo)無(wú)相關(guān)性。提示GDM組孕期體重增加過(guò)多導(dǎo)致Chemerin功能失衡,可能與GDM能量代謝異常有關(guān)。 (3)GDM組新生兒出生體重和臍帶血Chemerin水平均較正常對(duì)照組明顯增加,推斷Chemerin與GDM子代的并發(fā)癥有關(guān)。 第二部分妊娠期糖尿病患者脂肪和胎盤Chemerin mRNA以及蛋白表達(dá)的變化 研究目的： 分別檢測(cè)GDM組和正常對(duì)照組脂肪和胎盤組織中Chemerin mRNA以及蛋白表達(dá)的變化,探討Chemerin在妊娠期脂肪和胎盤組織中的分布情況以及與GDM的關(guān)系。 方法： 選取2012年1月到2012年10月在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院產(chǎn)科門診定期產(chǎn)檢并住院待產(chǎn)的孕婦,參照2011年ADA診斷標(biāo)準(zhǔn)于孕24～28周診斷為GDM46例為GDM組,同期選取年齡、孕周、孕前體重指數(shù)等指標(biāo)與實(shí)驗(yàn)組相匹配的孕婦43例為正常對(duì)照組,所有入選病例均于37-40周分娩。擇期剖腹產(chǎn)手術(shù)時(shí)采集產(chǎn)婦下腹部皮下脂肪約5g；胎盤娩出后留取臍帶根部胎盤組織lcm x lcm x lcm,所有組織均液氮保存。通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)GDM組和正常對(duì)照組脂肪及胎盤組織中Chemerin mRNA表達(dá)；通過(guò)Westernblot檢測(cè)兩組脂肪和胎盤組織中Chemerin蛋白表達(dá)。結(jié)果： 1.總RNA提取的質(zhì)量檢測(cè)：通過(guò)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性。紫外燈下可見(jiàn)28s,18s,5s三條rRNA的條帶清晰,28s條帶的強(qiáng)度高于18s將近2倍,18s條帶的強(qiáng)度又高于5s,表明RNA質(zhì)量良好。 2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增(SYBRGreenI熒光定量PCR相對(duì)定量法)。 2.1擴(kuò)增曲線： 通過(guò)PCR儀自動(dòng)生成的擴(kuò)增曲線可以看到目的基因Chemerin以及內(nèi)參基因Actin擴(kuò)增曲線的線條圓滑,跨度大體一致,提示基因的擴(kuò)增表達(dá)情況良好。 2.2兩組脂肪和胎盤組織Chemerin mRNA表達(dá)比較： GDM組脂肪組織和胎盤組織Chemerin mRNA平均表達(dá)量均高于正常對(duì)照組。差異具有顯著性(P0.01)。 3.兩組脂肪和胎盤組織Chemerin蛋白表達(dá)比較：經(jīng)過(guò)灰度分析統(tǒng)計(jì),GDM組脂肪和胎盤Chemerin/GAPDH均值均明顯高于正常對(duì)照組,差異具有顯著性(P0.01)。 結(jié)論： (1) Chemerin在妊娠期脂肪和胎盤組織中均有表達(dá),參與正常妊娠生理代謝過(guò)程。 (2)GDM組脂肪組織和胎盤Chemerin mRNA和蛋白表達(dá)量均高于正常對(duì)照組,提示脂肪源性和胎盤源性的Chemerin參與GDM的發(fā)生發(fā)展。 第三部分妊娠期糖尿病患者Chemerin基因的單核苷酸多態(tài)性分析 研究目的 采用基因擴(kuò)增后直接測(cè)序法分析妊娠期糖尿病患者Chemerin SNPs的變化和分布；進(jìn)一步闡明Chemerin SNPs與妊娠期糖尿病臨床指標(biāo)的關(guān)系。 方法： 選取2012年1月到2013年10月在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院產(chǎn)科門診定期產(chǎn)檢并住院分娩的孕婦,參照2011年ADA診斷標(biāo)準(zhǔn)于孕24～28周診斷為GDM330例為實(shí)驗(yàn)組；同期選取年齡、孕周、孕前體重指數(shù)等指標(biāo)與實(shí)驗(yàn)組相匹配的孕婦329例作為正常對(duì)照組,所有入選病例均于37-40周在本院分娩。各受試者進(jìn)行空腹血糖、甘油三酯等生化指標(biāo)的檢測(cè)。基于文獻(xiàn)、NCBI及生物信息學(xué)軟件,篩查到rs3735170、rs6970196、rs10244748、rs17173608、rs1804764、rs3210475、 rs10278590(rs4721)、rs3735168、rs9942696、rs17835937十個(gè)位點(diǎn)。提取所有受試者基因組DNA,用直接測(cè)序法分析上述位點(diǎn)基因型,并進(jìn)行相關(guān)分析。 結(jié)果 1.研究對(duì)象的臨床特征：兩組實(shí)驗(yàn)對(duì)象的年齡、孕周、孕前BMI、SBP、DBP、 TC、HDL-C、LDL-C、Cr、BUN、ALT、GOT均沒(méi)有顯著性差異(P均0.05)；兩組FPG、TG、WBC、CRP、HOMA-IR、Fins均有顯著性差異(P均0.05)。 2.測(cè)序：各SNP位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果均與探針?lè)ǚ中徒Y(jié)果完全一致。 3.基因型和等位基因頻率分析 3.1HWE檢驗(yàn)： 經(jīng)Hardy-Weinberg檢驗(yàn)分析,7個(gè)位點(diǎn)的P值均遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于界值0.05,所研究的7個(gè)SNPs位點(diǎn)上觀察值與期望值相吻合,各基因頻率達(dá)到遺傳平衡,研究資料具有群體代表性,證明它們符合Hardy-Weinberg平衡。 3.2各SNP位點(diǎn)病例對(duì)照研究 rs3735170位點(diǎn)的C等位基因頻率在孕婦GDM病例組中為13.5%,正常對(duì)照組中為33.4%,C等位基因?yàn)镚DM的保護(hù)因素(P=0.038),OR為0.303(0.103-0.886)；T等位基因頻率在GDM組為86.5%,正常對(duì)照組為66.6%,攜帶C的基因型CC+CT vsTT在GDM組中的分布頻率亦降低,P值為0.027,達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 rs17173608的C等位基因頻率在GDM組為1.7%,正常對(duì)照組為13.3%,C等位基因?yàn)镚DM的保護(hù)因素(P=0.039),OR為0.132(0.015-1.177)；A等位基因頻率在GDM組為98.3%,在正常對(duì)照組為86.7%,攜帶C的基因型CC+CA vs AA在GDM組中的分布頻率亦降低,P值為0.039,達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 rs9942696的T等位基因頻率在GDM組為25.2%,正常對(duì)照組為16.3%,T等位基因?yàn)镚DM的高危因素,OR為3.354(1.062-10.590)；C等位基因頻率在GDM組為74.8%,在正常對(duì)照組為83.7%,攜帶T的基因型TT+TC vs CC在GDM組中的分布頻率升高,P值為0.035,達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 其余SNP位點(diǎn)的等位基因及攜帶的相關(guān)基因型在兩組間未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 3.3LD檢驗(yàn)： 沒(méi)有位點(diǎn)在同一個(gè)LD block內(nèi),未發(fā)現(xiàn)有與GDM發(fā)生相關(guān)的單倍體型。 4.各基因型間臨床及生化指標(biāo)比較：rs17173608和rs9942696位點(diǎn)各基因型之間未見(jiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異指標(biāo)；rs3735170位點(diǎn)在孕期體重增加、FPG、TC、LDL指標(biāo)中存在基因型組間顯著性差異。 結(jié)論 Chemerin rs3735170(TC)的不同基因型與GDM的發(fā)生存在著一定的聯(lián)系。
【圖文】：

糖尿病中的作用受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，但是具體作用機(jī)制還不清楚。根據(jù)脂肪細(xì)胞因子發(fā)現(xiàn)順序（如圖1 ) , Chemerin是最近發(fā)現(xiàn)的脂肪細(xì)胞因子。2007年Bozaoglu_等用信號(hào)序列捕獲技術(shù)首次確定Chemerin是一種脂肪細(xì)胞因子，由Chemerin基因（CHEMERIN基因）編碼，其編碼基因全長(zhǎng)3289bp,位于染色體7q36.1,由6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子組成。Chemerin有3種受體：Chemerin樣受體1(CMKLR 1)、肥大細(xì)胞表面趨化因子受體2(CCRL2)以及GPcRs家族成員GPRl[i'IChemerin主要通過(guò)自分泌或旁分泌途徑作用于CMKLR1受體而實(shí)現(xiàn)其生物學(xué)功能，如參與炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)糖脂代謝等。其表達(dá)水平與肥胖相關(guān)，并有調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞的分化、脂解，促進(jìn)脂肪細(xì)胞內(nèi)姨島素信號(hào)傳導(dǎo)途徑等生物學(xué)效應(yīng)。IL-6 LEPTIN PAM AGT ZAG OmentinPTq jg PJ JUT]r^——— —1992 1993 1994 1^5 ia?7 1C?$ 咖 1 2034 2005 2C06 ￡007T7'0F-ct Adipc'rieclin SAA Chemerin【iT?9 (4) jeiR&P4c,iijV-eis pin p.kpjVlsfatin圖1脂肪細(xì)胞因子發(fā)現(xiàn)順序Chemerin具有促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化功能。Goralski等[丨2]，11011等[】3]，Takahashi等[14】研究報(bào)遒，人前脂肪細(xì)胞和成纖維細(xì)胞(3T3-L1)向脂肪細(xì)胞分化的過(guò)程中

圖2 GDM與正常對(duì)照組臨床資料的比較（f±s)組血糖、血脂、炎癥指標(biāo)、胰島素、外周血ChemerinDM組外周血Chemerin水平顯著高于正常對(duì)照組（分別為20.11±363±3.63pg/ml, P=0.001 )；同時(shí)，F(xiàn)PG、Fins、TG、HbAlc 及 HOWBC 均高于正常對(duì)照組（分別為 6.07±1.74mmol/L, 13.50±2..33mmol/L, 6.10±1.90%, 3.40±1.51，5.04士1.96mg/L, 8.71±1.87 ( x.91mmol/L, 11.63±4.31 mu/L, 3.19±0.96mmol/L, 5.20士0.90%，2.1.17mg/L，，7.85±1.55 ( xlO^/L )，P 均<0.05 );而兩組間 TC、HDL、無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均>0.05),見(jiàn)表2,圖3，表3，圖4。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R714.256

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2669147