【摘要】：目的:乙�；D(zhuǎn)移酶MOF是MYST家族中的一員,通過介導(dǎo)組蛋白H4K16的乙�；瘏⑴c活性化的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。文獻(xiàn)報(bào)道表明,MOF參與多種重要的細(xì)胞功能,如細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng),細(xì)胞周期進(jìn)程,DNA損傷修復(fù)與自噬等功能。研究發(fā)現(xiàn)MOF在不同的腫瘤中發(fā)揮不同的功能,如在肝癌、乳腺中低表達(dá)發(fā)揮抑癌的作用,而在肺癌中高表達(dá)發(fā)揮促癌的作用。然而MOF在子宮內(nèi)膜癌中的生物學(xué)功能尚不明確,還需進(jìn)一步闡明。子宮內(nèi)膜癌是常見的女性生殖道惡性腫瘤,按照發(fā)病機(jī)制和生物學(xué)行為特點(diǎn)分為兩種類型。子宮內(nèi)膜癌患者中約80%屬于I型子宮內(nèi)膜癌,此種類型與體內(nèi)高雌激素狀態(tài)、肥胖及雌激素受體(Estrogen Receptorα,ERα)陽性表達(dá)相關(guān),且多為子宮內(nèi)膜樣腺癌。雌激素受體α(ERα)是配體依賴的轉(zhuǎn)錄因子,主要通過接受雌激素的刺激而發(fā)揮生物學(xué)功能。ERα在子宮內(nèi)膜癌這類雌激素相關(guān)的腫瘤中參與調(diào)節(jié)雌激素誘導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)及增殖。然而,ERα在組織學(xué)分級(jí)為III級(jí)的子宮內(nèi)膜癌標(biāo)本中呈低表達(dá),并且ERα的高表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌患者術(shù)后長(zhǎng)期的無病生存有相關(guān)性。這些研究表明ERα在子宮內(nèi)膜癌的進(jìn)程中發(fā)揮重要而復(fù)雜的作用,尤其是ERα在組織學(xué)分級(jí)為較高級(jí)別(III級(jí))的子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)降低的分子機(jī)制需深入解析。在本研究中,我們的目的旨在明確MOF在子宮內(nèi)膜癌中的生物學(xué)功能,以及MOF與ERα在子宮內(nèi)膜癌中的特征性表達(dá)、復(fù)雜功能的關(guān)聯(lián)及相關(guān)分子機(jī)制,為研發(fā)子宮內(nèi)膜癌治療方法提供新靶點(diǎn)。研究方法:1、本研究首先通過功能學(xué)實(shí)驗(yàn),在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞及小鼠體內(nèi)檢測(cè)MOF在子宮內(nèi)膜癌中的生物學(xué)功能。2、進(jìn)一步在臨床標(biāo)本中運(yùn)用免疫組化的方法分析MOF在200例子宮內(nèi)膜癌組織與26例良性子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)差異,及其與臨床病理特征的關(guān)系。通過上述分析明確了MOF與ERα表達(dá)的關(guān)聯(lián),進(jìn)而深入研究其中的分子機(jī)制。3、首先利用蛋白質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證MOF與ERα的相互作用。其次Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MOF過表達(dá)和敲低對(duì)ERα蛋白表達(dá)的影響。通過加入蛋白合成抑制劑CHX檢測(cè)MOF和MOF突變體MOF K274R對(duì)ERα蛋白降解速度的影響;通過加入蛋白酶體抑制劑MG132檢測(cè)MG132對(duì)敲低MOF引起的ERα蛋白表達(dá)減少的逆轉(zhuǎn)作用。最后利用蛋白質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MOF及乙�；D(zhuǎn)移酶活性失活的MOF突變體MOFK274R是否在細(xì)胞內(nèi)乙�；疎Rα,并檢測(cè)其乙酰化ERα的賴氨酸位點(diǎn)。4、通過RNA microarray技術(shù),從全基因組角度檢測(cè)MOF與ERα共同調(diào)控的基因,并了解這些基因參與的功能范疇;再利用實(shí)時(shí)定量PCR和染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP assay)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步鑒定篩選出的MOF與ERα共同調(diào)控的基因。結(jié)果:1、敲低MOF促進(jìn)了子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的生長(zhǎng)及增殖。生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)證實(shí)敲低MOF能夠促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞(Ishikawa和HEC-1A細(xì)胞)的增殖�？寺⌒纬蓪�(shí)驗(yàn)證實(shí),與對(duì)照組相比敲低MOF促進(jìn)了細(xì)胞克隆形成的數(shù)量。流式細(xì)胞儀的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,敲低MOF引起了G1期細(xì)胞減少及G2/M期細(xì)胞阻滯。小鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)表明,與對(duì)照組相比敲低MOF組的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞(Ishikawa細(xì)胞)在小鼠(雌性,NOD/SCID小鼠)體內(nèi)形成更大的腫瘤,并且腫瘤的生長(zhǎng)速度更快。2、在子宮內(nèi)膜癌組織中,MOF呈低表達(dá)且與ERα的表達(dá)呈正相關(guān)。免疫組化結(jié)果表明,與良性子宮內(nèi)膜組織相比MOF在子宮內(nèi)膜癌組織(病理類型為子宮內(nèi)膜樣腺癌)中呈低表達(dá)(P0.01)。臨床資料統(tǒng)計(jì)分析顯示在子宮內(nèi)膜癌組織(病理類型為子宮內(nèi)膜樣腺癌)中,MOF在Ⅲ級(jí)子宮內(nèi)膜癌組織中呈低表達(dá),且與ERα的表達(dá)呈正相關(guān)。Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了20例新鮮子宮內(nèi)膜癌組織(病理類型為子宮內(nèi)膜樣腺癌)中MOF與ERα的表達(dá)情況。與免疫組化的結(jié)果一致,MOF與ERα的表達(dá)呈正相關(guān)。3、MOF與ERα相互作用并調(diào)節(jié)ERα蛋白的穩(wěn)定性。蛋白質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)內(nèi)源和外源的MOF與ERα在細(xì)胞內(nèi)相互作用。共聚焦顯微鏡下觀察,MOF主要定位在Ishikawa細(xì)胞的細(xì)胞核中。在雌激素存在的條件下,MOF與ERα部分共定位于Ishikawa細(xì)胞的細(xì)胞核中。Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)敲低MOF并不影響ERαmRNA的表達(dá),但ERα的蛋白表達(dá)降低。Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)在加入蛋白合成抑制劑放線菌酮(CHX)的條件下,MOF能夠延緩ERα的蛋白降解,維持ERα蛋白的穩(wěn)定,然而乙酰基轉(zhuǎn)移酶活性失活的MOF突變體MOFK274R不能夠維持ERα蛋白的穩(wěn)定。蛋白酶體抑制劑MG132能夠逆轉(zhuǎn)由于敲低MOF引起的ERα蛋白表達(dá)的降低。蛋白質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)表明ERα在子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞中能夠被乙�；�,并且MOF與已報(bào)道的p300作用相似,能夠在細(xì)胞內(nèi)乙�；疎Rα。然而,乙�；D(zhuǎn)移酶酶活性失活的MOF突變體MOFK274R不能夠乙�；疎Rα。此外,根據(jù)已報(bào)道的p300乙�；疎Rα的位點(diǎn),我們構(gòu)建了ERα的突變體:ERαK266R,ERαK268R,ERαK299R,ERαK302R,ERαK303R以及ERαK302R/K303R。蛋白質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)表明與野生型的ERα乙�；较啾�,ERα的突變體(K266R,K268R,K299R,K303R和K302R/K303R)乙酰化水平降低。4、在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中,MOF與ERα共同調(diào)控了一組內(nèi)源基因。構(gòu)建穩(wěn)定敲低MOF的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞及對(duì)照細(xì)胞,給予雌激素(E2)和不給予雌激素處理,共4組。通過RNA microarray技術(shù),從全基因組角度檢測(cè)4組之間的差異,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明雌激素(E2)調(diào)節(jié)的差異基因有1280個(gè),MOF敲低組在有無雌激素(E2)刺激的條件下,分別有2807個(gè)和2054個(gè)差異基因。KEGG分析表明在雌激素(E2)存在的條件下,MOF影響的差異基因主要參與代謝通路,癌癥通路,MAPK信號(hào)通路,細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用通路以及細(xì)胞周期通路。受雌激素(E2)調(diào)節(jié)的1280個(gè)基因中,在雌激素(E2)存在的條件下,敲低MOF組有18.8%(241個(gè)基因)的基因明顯下調(diào)。進(jìn)一步挑選在雌激素(E2)存在的條件下,明顯受到MOF調(diào)節(jié)的且參與腫瘤進(jìn)程的基因制成熱圖。利用實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)了RNA microarray的篩選結(jié)果,其中受雌激素(E2)調(diào)控的DNA損傷相關(guān)自噬調(diào)節(jié)因子1(DRAM1)和TAGLN基因同時(shí)也受到MOF的調(diào)節(jié)。已知乳腺癌中的ERα下游靶基因PGR和E2F1在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中并不受MOF的明顯調(diào)控。染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)(ChIP assay)證實(shí)在雌激素(E2)存在的條件下,MOF和ERα可以募集到DRAM1啟動(dòng)子雌激素作用元件Ⅰ區(qū),通過調(diào)節(jié)組蛋白H4K16乙�；秸{(diào)節(jié)DRAM1基因的轉(zhuǎn)錄。結(jié)論:1、MOF參與抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的生長(zhǎng)及增殖。2、MOF在子宮內(nèi)膜癌組織中呈低表達(dá)且與ERα的表達(dá)呈正相關(guān)。3、MOF與ERα在細(xì)胞內(nèi)相互作用并通過乙�；瘏⑴c維持ERα蛋白的穩(wěn)定。4、MOF和ERα在全基因組范圍內(nèi)共同調(diào)控了子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中的一組內(nèi)源基因。
【圖文】：

圖 3.2 MOF 在子宮內(nèi)膜癌組織中呈較低表達(dá)，且與 ERα 表達(dá)呈正相關(guān)A: 免疫組化染色表明與良性子宮內(nèi)膜組織（BET）相比，MOF 在子宮內(nèi)膜癌組織中表達(dá)較低。放大倍數(shù)，×40；標(biāo)尺，50μm。B：MOF 在子宮內(nèi)膜癌組織中的Hscore評(píng)分低于良性子宮內(nèi)膜組織。箱式圖的橫線代表中位數(shù)，底部和頂部分別代表上四分位數(shù)和下四分位數(shù)；豎線代表數(shù)據(jù)的幅度范圍。**，P<0.01。C：在較高級(jí)別的子宮內(nèi)膜癌組織中（組織學(xué)分級(jí)為Ⅲ級(jí)）MOF的Hscore評(píng)分降低。**，P<0.01。D: western blot 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)新鮮冰凍子宮內(nèi)膜癌組織中MOF與ERα的蛋白表達(dá)情況。E: MOF與ERα的蛋白表達(dá)在子宮內(nèi)膜癌中呈正相關(guān)。利用ImageJ軟件對(duì)western blot 條帶（D）進(jìn)行量化分析，將得到的灰度值采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。運(yùn)用SPSS進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，，Pearson r值為0.6712，P=0.0012。

圖3.3.1 MOF與ERα在細(xì)胞內(nèi)相互作用A：免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)表明外源的FLAG-MOF能夠與ERα在Ishikawa細(xì)胞內(nèi)相互作用。Ishikawa細(xì)胞予以E2（10-8M）刺激與不刺激處理。利用anti-FLAG抗體或IgG（作為對(duì)照）進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，沉淀蛋白復(fù)合物用相應(yīng)的抗體進(jìn)行western blot分析。B：免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)表明內(nèi)源的MOF能夠與ERα在Ishikawa細(xì)胞內(nèi)相互作用。利用anti-MOF抗體或IgG（作為對(duì)照）進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，沉淀蛋白復(fù)合物用相應(yīng)的抗體進(jìn)行western blot分析。C: 共聚焦激光掃描顯微鏡下觀察到MOF與ERα在Ishikawa細(xì)胞中共定位于細(xì)胞核。Ishikawa細(xì)胞予以E2（10-8M）刺激與不刺激處理。紅色表示ERα的抗體染色，綠色表示MOF的抗體染色，藍(lán)色為DAPI，用來定位細(xì)胞核。Merge為共定位的結(jié)果。標(biāo)尺，10 。實(shí)驗(yàn)過程中我們發(fā)現(xiàn)在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系Ishikawa細(xì)胞和HEC-1A細(xì)胞中，MOF敲低并不影響ERα的mRNA表達(dá)，但是影響ERα的蛋白表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明當(dāng)MOF表達(dá)減少時(shí)，ERα蛋白表達(dá)也降低（圖3.3.2 A和B）。過表達(dá)MOF，ERα
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R737.33

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本文編號(hào)：2668764