本文關(guān)鍵詞：PLGA-DOTAP作為siRNA納米遞送載體用于RNA干擾子宮內(nèi)膜異位癥的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究目的本研究欲探討RNA干擾技術(shù)(RNAi)用于治療子宮內(nèi)膜異位癥(EMs)的可能性,并首次評價PLGA-DOTAP/siRNA納米微球作用于EMs間質(zhì)細胞的安全性,遞送siRNA至EMs間質(zhì)細胞的可行性,siRNA在細胞內(nèi)能否發(fā)揮生物學(xué)功能。為未來PLGA-DOTAP作為RNAi遞送載體用于治療EMs提供實驗基礎(chǔ)。方法1.標(biāo)本采集:選取就診于天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院并手術(shù)治療的卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫患者6例,術(shù)中取卵巢EMs病灶并原代培養(yǎng)EMs間質(zhì)細胞。所有患者無內(nèi)分泌、代謝性及免疫系統(tǒng)疾病,無惡性腫瘤史,6個月內(nèi)無妊娠、哺乳及激素治療史。2.實驗方法2.1原代培養(yǎng)卵巢EMs間質(zhì)細胞,并鑒定細胞。2.2制備PLGA-DOTAP納米微球,透射電鏡掃描結(jié)構(gòu)。激光粒度儀檢測粒徑、Zeta電位。2.3瓊脂糖凝膠電泳測定不同N/P比PLGA-DOTAP納米微球包載siRNA的能力。2.4 CCK-8檢測不同RNA終濃度、不同N/P比PLGA-DOTAP/siRNA對EMs間質(zhì)細胞的毒性。2.5共聚焦顯微鏡檢測PLGA-DOTAP/siRNA轉(zhuǎn)染EMs間質(zhì)細胞。2.6 PLGA-DOTAP/mi R-142-3p mimic轉(zhuǎn)染EMs間質(zhì)細胞,RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后6小時細胞內(nèi)mi R-142-3p mimic含量,評估PLGA-DOTAP轉(zhuǎn)染效率;RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后48小時細胞內(nèi)gp130 mRNA表達差異。2.7 PLGA-DOTAP/STAT3 siRNA轉(zhuǎn)染EMs間質(zhì)細胞,RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后48小時細胞內(nèi)STAT3 m RNA表達改變。結(jié)果1.通過O/W乳化溶劑揮發(fā)法制備PLGA-DOTAP納米微球,透射電子顯微鏡示PLGA-DOTAP復(fù)合物形成一類界線明顯,粒子大小相似,具有核殼結(jié)構(gòu)的球型粒子。Zeta電位為28.3±1.5mv,粒徑為231.2±10.5nm。PLGA-DOTAP納米微球大小較一致,相對穩(wěn)定。2.PLGA-DOTAP與siRNA通過正負電荷結(jié)合,N/P比3:1時,PLGA-DOTAP與siRNA的結(jié)合效率低,當(dāng)N/P比增大至6:1或更高時,PLGA-DOTAP能夠較高效率結(jié)合siRNA。PLGA-DOTAP對EMs間質(zhì)細胞有細胞毒性,毒性隨PLGA-DOTAP用量增多而增大。當(dāng)RNA終轉(zhuǎn)染濃度為100nmol/L時,N/P比10:1和15:1的PLGA-DOTAP組細胞毒性小于Lipo組(P0.05)。當(dāng)增加PLGA-DOTAP組RNA濃度至200nmol/L時,N/P比10:1和15:1的PLGA-DOTAP組細胞毒性增加,與100nmol/L RNA濃度的Lipo組無差別(P0.05)。共聚焦顯微鏡示PLGA-DOTAP/siRNA能夠?qū)iRNA遞送入胞漿內(nèi),轉(zhuǎn)染后細胞形態(tài)無明顯改變。3.mi R-142-3p mimic轉(zhuǎn)染后6小時,PLGA-DOTAP/mimic組和Lipo組EMs細胞內(nèi)mi R-142-3p mimic含量均升高(P0.01)。隨著PLGA-DOTAP/mimic用量增加,PLGA-DOTAP/mimic組細胞內(nèi)mimic含量增加。當(dāng)RNA轉(zhuǎn)染濃度相同時,PLGA-DOTAP/mimic組細胞內(nèi)mimic含量多于Lipo組(N/P比15:1組P0.05)。轉(zhuǎn)染后48小時,PLGA-DOTAP/mimic組和Lipo組細胞內(nèi)gp130 m RNA均下調(diào)(P0.05)。當(dāng)RNA濃度為100nmol/L,PLGA-DOTAP/mimic組gp130 m RNA下調(diào)水平弱于Lipo組(P0.05)。增加PLGA-DOTAP/mimic組RNA濃度至200nmol/L,PLGA-DOTAP/mimic組gp130 m RNA下調(diào)程度能夠達到甚至超過RNA濃度100nmol/L的Lipo組。4.STAT3 siRNA轉(zhuǎn)染后48小時,PLGA-DOTAP/STAT3 siRNA組和Lipo組細胞內(nèi)均表達下調(diào)STAT3 m RNA。當(dāng)RNA濃度100nmol/L,PLGA-DOTAP/STAT3siRNA組STAT3 m RNA下調(diào)水平弱于Lipo組(P0.05)。增加PLGA-DOTAP/STAT3 siRNA組RNA濃度至200nmol/L,PLGA-DOTAP/STAT3siRNA組STAT3 m RNA下調(diào)程度能夠達到甚至超過RNA濃度100nmol/L的Lipo組。結(jié)論1、PLGA-DOTAP自組裝為納米微球復(fù)合物,且較穩(wěn)定,N/P比≥6:1時能夠有效包載siRNA,形成PLGA-DOTAP/siRNA復(fù)合物。2、PLGA-DOTAP/siRNA能夠順利遞送siRNA至EMs間質(zhì)細胞內(nèi),PLGA-DOTAP在一定劑量內(nèi)對EMs間質(zhì)細胞損傷不大。3、PLGA-DOTAP/siRNA復(fù)合物向EMs間質(zhì)細胞遞送siRNA的效率高于Lipofectamine 2000試劑。4、PLGA-DOTAP/siRNA復(fù)合物向EMs間質(zhì)細胞內(nèi)遞送的siRNA能夠發(fā)揮生物學(xué)功能,作用特定靶mRNA,且能夠緩慢控制釋放siRNA。5、PLGA-DOTAP復(fù)合物作為遞送材料用于EMs的RNAi治療具有美好遠景和廣闊的發(fā)展空間,可在子宮內(nèi)膜異位癥的預(yù)防和治療方面發(fā)揮作用。
【關(guān)鍵詞】：子宮內(nèi)膜異位癥 RNA干擾 PLGA-DOTAP 遞送載體 siRNA
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R711.71
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-11
• 縮略語11-12
• 前言12-16
• 研究現(xiàn)狀、成果12-15
• 研究目的、方法15-16
• 材料與方法16-33
• 1 材料16-19
• 1.1 研究病例16
• 1.2 實驗材料16-18
• 1.3 主要實驗儀器及耗材18-19
• 1.4 試劑配置19
• 2 方法19-33
• 2.1 PLGA-DOTAP/siRNA納米微球的合成及表征19-21
• 2.2 卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫間質(zhì)細胞原代培養(yǎng)及鑒定21-23
• 2.3 PLGA-DOTAP/siRNA復(fù)合物對卵巢EMs間質(zhì)細胞的細胞毒性檢測23
• 2.4 共聚焦顯微鏡觀察PLGA-DOTAP/FAM-N.C.siRNA納米微球轉(zhuǎn)染EMs間質(zhì)細胞23-24
• 2.5 測定PLGA-DOTAP/miR1423p mimic對EMs間質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)染效果24-30
• 2.6 測定PLGA-DOTAP/STAT3 siRNA對卵巢EMs間質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)染效果30-33
• 結(jié)果33-46
• 1 PLGA-DOTAP/siRNA納米微球復(fù)合物的制備和表征33-37
• 2 卵巢EMs間質(zhì)細胞原代培養(yǎng)及鑒定37-39
• 3 PLGA-DOTAP/siRNA對EMs間質(zhì)細胞的毒性39-40
• 4 激光共聚焦顯微鏡測定PLGA-DOTAP/siRNA對EMs間質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)染情況40-42
• 5 PLGA-DOTAP/miR1423p mimics轉(zhuǎn)染EMs間質(zhì)細胞對gp130 mRNA表達水平的影響42-44
• 6 PLGA-DOTAP/STAT3 siRNA轉(zhuǎn)染EMs間質(zhì)細胞對STAT3 mRNA表達水平的影響44-46
• 討論46-55
• 1 子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展46
• 2 EMs中microRNA的改變46-47
• 3 STAT3信號通路47-48
• 4 RNAi技術(shù)48-50
• 5 RNAi治療子宮內(nèi)膜異位癥50-54
• 6 局限性及展望54-55
• 結(jié)論55-56
• 參考文獻56-63
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明63-64
• 綜述 子宮內(nèi)膜異位癥中miRNA表達異常及RNA干擾技術(shù)的應(yīng)用價值64-77
• 綜述參考文獻72-77
• 致謝77-79
• 個人簡歷79

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