【摘要】：卵巢惡性腫瘤是女性生殖道腫瘤中致死率最高的惡性腫瘤,包括多種病理學類型,其中最常見的是上皮性卵巢癌,因卵巢位于盆腔的深處,早期診斷較為困難,且缺乏有效的篩查手段,故卵巢癌患者就診時,多數已處于晚期。此外卵巢癌容易出現盆腹腔廣泛轉移、淋巴結轉移,所以在女性生殖系統(tǒng)腫瘤中,上皮性卵巢癌的病死率是最高的。腫瘤發(fā)生、發(fā)展受到多方面因素的影響,包含細胞運動、抑癌或促癌基因表達失調、遷移調控異常等等。目前卵巢癌的標準治療策略是手術并輔以鉑類為基礎的化療,雖然多數患者最初對這種治療方案有反應,但最終會死于復發(fā)和耐藥,因此,迫切需要進一步探索卵巢癌發(fā)病和發(fā)展的分子機制,開發(fā)新的治療方法,以期提高患者的生存率。眾所周知,惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展受到多方面因素的影響,包含癌基因激活、抑癌基因的失活,從而導致機體內相關信號通路出現異常,促進細胞增殖,形成新生血管、發(fā)生遠處轉移等。目前對于腫瘤細胞如何發(fā)生轉移,具體機制并不確定,有相關結論提出,腫瘤細胞在運動過程中,在腫瘤微環(huán)境的支持下,融入到血液循環(huán)系統(tǒng)中,因此被認為是大部分腫瘤發(fā)生轉移的啟動元素,而當腫瘤微環(huán)境在促進腫瘤細胞運動過程中,其主要機制即為上皮-間質轉化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT),它是上皮細胞在特定情況下轉變?yōu)殚g充質細胞的形態(tài)學過程,在癌癥侵襲-轉移過程中扮演著重要的作用,該過程涉及眾多基因可逆、快速的改變。越來越多的研究發(fā)現,腫瘤細胞與上皮-間質轉化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)之間存在密切關聯(lián),細胞在腫瘤微環(huán)境中各種成分的相互作用下,可以激活EMT相關轉錄因子信號通路使上皮細胞向間充質細胞轉換,從而使得腫瘤細胞發(fā)生浸潤和轉移。EMT相關轉錄因子如Slug,Snail和Zebl等可以誘導腫瘤細胞發(fā)生EMT,使得腫瘤的侵襲和轉移能力增強。另外EMT轉換能夠賦予腫瘤細胞干細胞樣的特征,提高腫瘤細胞的抗凋亡能力,促進惡性腫瘤的發(fā)展。然而目前靶向EMT相關轉錄因子的研究并不成熟,EMT的發(fā)生機制涉及多個方面,不僅有轉錄因子的參與,近年來microRNAs(miRNAs)在EMT及腫瘤進展中的角色逐步顯現并成為大家關注的熱點。更多的研究指出,在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉移過程中,microRNAs(miRNAs)扮演了非常重要的角色,并可能為改善腫瘤患者的治療結局提供有效的治療策略。miRNA是一類小的非編碼RNA(長度為19-24 nt),通過與3'-非翻譯區(qū)(3'-UTRs)結合調控靶基因的表達,導致mRNA的降解或翻譯抑制。miRNA及其調控的靶基因構成一個調控網絡,動態(tài)調控各種生物學行為。迄今為止,已發(fā)現miR-320a在許多類型的癌癥中表達上調或下調,例如肝細胞癌,結腸癌,胃癌和前列腺癌。然而,到目前為止,關于miR-320a和上皮性卵巢癌的相關性的研究鮮有報道。最新有研究分析了從GEO下載的卵巢癌樣本,共獲得了 17個顯著差異表達的miRNA,共表達的網絡顯示has-miR-320的高表達在卵巢癌樣本中顯示預后不良,但是miR-320a在EOC中的具體作用機制目前尚無報道。本研究的目的就是探討miR-320a在上皮性卵巢癌中的表達及其生物學作用。生物信息學軟件預測發(fā)現,miR-320a在RASSF8 mRNA的3'-UTR區(qū)具有潛在結合位點,提示miR-320a可能對RASSF8的表達有靶向調控作用。RASSF8,是一種腫瘤抑制基因,對維持上皮細胞的AJs(附著力粘連點)功能至關重要,并在上皮細胞遷移中發(fā)揮作用。RASSF8已被證明在小鼠胚胎和成人的正常組織中普遍表達,并被描述為肺癌、皮膚黑色素瘤和食管鱗狀細胞癌發(fā)生的潛在腫瘤抑制因子。RASSF8可通過Wnt和NF-κB信號通路對惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展起到抑制作用,不僅可以抑制惡性腫瘤細胞增殖,還可以促進細胞凋亡,故其在多種腫瘤中起到抑癌基因的作用,但RASSF8在上皮性卵巢癌中的作用至今未有報道。RASSF8在上皮性卵巢癌中能否發(fā)揮作用、它在上皮性卵巢癌中的表達及與miR-320a的關系如何,它可能的調控機制是什么?這些問題目前未有報道,值得我們進一步探討。本課題旨在研究miR-320a在上皮性卵巢癌中的表達及其生物學作用,并進一步明確miR-320a是否可以通過靶向調控RASSF8促進卵巢癌細胞增殖和轉移,探討miR-320a、RASSF8在卵巢癌細胞增殖及轉移中的可能的作用機制,以期為上皮性卵巢癌的治療提供新的理論依據。第一部分:miR-320a在上皮性卵巢癌組織、細胞系中的表達及細胞功能學研究研究目的1.研究miR-320a在上皮性卵巢癌組織(EOC)中的表達及與臨床病理特征的關系;2.探討miR-320a在上皮性卵巢癌細胞系中的表達及生物學功能,同時對上皮性卵巢癌中miR-320a可能的作用機制進行分析。研究方法1.應用實時定量PCR(qRT-PCR)方法檢測miR-320a在正常卵巢組織、卵巢良性腫瘤和上皮性卵巢癌組織中的表達情況,并分析miR-320a表達與臨床病理特征的關系。2.檢測miR-320a在卵巢癌細胞系SKOV3、OVCAR3、A2780和正常卵巢細胞系IOSE80中的表達。3.在miR-320a表達水平較低的SKOV3細胞中利用慢病毒構建穩(wěn)定過表達miR-320a的細胞株,在miR-320a表達水平較高的OVCAR3細胞中瞬時轉染miR-320a-inhibitor,應用CCK-8實驗、Transwell小室模型、細胞流式技術評價miR-320a對卵巢癌細胞的增殖,侵襲、遷移和凋亡能力的改變。行裸鼠成瘤試驗對miR-320a過表達后卵巢癌細胞裸鼠成瘤能力進行評價,從體內試驗進一步驗證miR-320a在卵巢癌中的作用。4.蛋白免疫印跡技術(Western blot)檢測過表達和下調miR-320a后卵巢癌細胞株中EMT相關指標的改變。HE染色觀察裸鼠生成瘤組織中腫瘤細胞形態(tài)及浸潤情況,免疫組織化學法對裸鼠生成瘤組織中E-cadherin和Vimentin表達進行評價。研究結果1.miR-320a在EOC組織中表達水平高于正常卵巢組織和卵巢良性腫瘤;卵巢癌晚期(Ⅲ期、Ⅳ期)組織中miR-320a的表達水平高于它在卵巢癌早期(Ⅰ期、Ⅱ期)樣本中的表達水平(P0.05),有淋巴結轉移組中miR-320a的表達水平高于無淋巴結轉移組(P0.05),但在年齡、組織學分類、病理學分級方面,miR-320a的表達水平無差異(P0.05)。2.miR-320a在三種卵巢癌細胞系(SKOV3、OVCAR3、A2780)中的表達均高于正常卵巢細胞IOSE80的表達。3.miR-320a能促進卵巢癌細胞的增殖、侵襲和遷移,對卵巢癌細胞凋亡無明顯影響。裸鼠成瘤試驗也證實miR-320a可以促進卵巢癌細胞的增殖。4.miR-320a可以促進卵巢癌細胞EMT行為。與對照組細胞相比,過表達miR-320a可以使SKOV3細胞中E-cadherin表達水平下降,而Vimentin的表達水平上升;下調miR-320a可以使OVCAR3細胞中E-cadherin表達水平上升,而Vimentin的表達水平下降。采用免疫組織化學方法對裸鼠成瘤組織中E-cadherin和Vimentin表達水平進行檢測,結果示:相較于SKOV3/miR-NC成瘤組,SKOV3/miR-320a成瘤組中的Vimentin表達水平相對更高,但E-cadherin表達水平卻低于前者。這些發(fā)現同樣支持了miR-320a可能促進EOC細胞EMT的假設。結論1.在上皮性卵巢癌組織及細胞系中miR-320a高表達,提示miR-320a可能是卵巢癌的潛在促癌基因,在上皮性卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用。2.miR-320a能促進卵巢癌細胞增殖、侵襲和遷移,對卵巢癌細胞凋亡無明顯影響;3.miR-320a可以促進卵巢癌細胞EMT行為。第二部分:miR-320a靶基因RASSF8的預測、鑒定研究目的通過第一部分研究發(fā)現,在上皮性卵巢癌組織及卵巢癌細胞系中miR-320a高表達,提示miR-320a可能作為促癌基因參與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展。那么miR-320a在卵巢癌中是通過哪個靶基因來發(fā)揮它的生物學功能的?本部分試驗通過生物信息學方法預測miR-320a的靶基因,在卵巢癌細胞中進一步驗證miR-320a如何靶向作用于靶基因,該問題的闡述可為深入理解卵巢癌的發(fā)病機制和探尋新的治療方法提供新的方向。研究方法1.采用生物信息學方法,利用三種生物信息學軟件(TargetScan miRTarBase,miRBase)對靶基因進行初步預測。2.采用qRT-PCR方法檢測RASSF8在卵巢癌細胞系(SKOV3,OVCAR3,A2780)與正常卵巢細胞系(IOSE80)中的mRNA水平,初步探討RASSF8在EOC中的作用。3.利用雙熒光素酶報告基因載體構建野生型pGL3-RASSF8-WT和突變型pGL3-RASSF8-Mut,與miR-320a共同轉染細胞,來觀察miR-320a過表達對突變型和野生型pGL3-RASSF8的熒光素酶活性的影響,進一步明確miR-320a是否可直接靶向作用于RASSF8的3'-UTR區(qū)。4.通過qRT-PCR及Western Blot方法分別對miR-320a過表達后的SKOV3細胞及miR-320a下調后的OVCAR3細胞中的RASSF8 mRNA和蛋白表達水平進行檢測,以進一步明確卵巢癌細胞中miR-320a與RASSF8的表達之間的關系。研究結果1.利用生物信息學方法,分析并預測RASSF8是miR-320a的靶基因。2.RASSF8在卵巢癌細胞系(SKOV3,OVCAR3,A2780)中的表達水平低于正常卵巢細胞系(IOSE80)。3.miR-320a可以靶向作用于RASSF8的3'-UTR區(qū)。4.miR-320a過表達或下調可以負性調控卵巢癌細胞中RASSF8的mRNA和蛋白水平。結論1.經實驗證實,RASSF8是miR-320a的靶基因。2.miR-320a可以負性調控RASSF8在卵巢癌中的表達水平。第三部分RASSF8對上皮性卵巢癌生物學的影響及調控機制的初步探討研究目的1.研究RASSF8在上皮性卵巢癌組織中的表達;2.探討RASSF8在上皮性卵巢癌細胞中的生物學作用,并探索其在上皮性卵巢癌中可能的調控機制。研究方法1.應用免疫組化方法檢測RASSF8在正常卵巢組織、卵巢良性腫瘤和上皮性卵巢癌組織中的表達情況。采用qRT-PCR方法對20例卵巢癌組織和20例癌旁正常組織中RASSF8 mRNA的表達進行研究。2.將靶向RASSF8的siRNA和Negative Control轉染入SKOV3細胞,應用CCK-8實驗、Transwell小室模型評價RASSF8下調后卵巢癌細胞的增殖,侵襲、遷移能力的變化。3.蛋白免疫印跡技術(Western blot)檢測RASSF8下調后NF-κB信號通路P65,p-P65,IκBα表達的改變。研究結果1.免疫組化結果顯示RASSF8在卵巢癌組織中的表達量明顯低于正常卵巢上皮及卵巢良性腫瘤,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。qRT-PCR方法對20例卵巢癌組織和20例癌旁正常組織中RASSF8 mRNA的表達進行研究,結果顯示:與癌旁正常組織相比,RASSF8 mRNA在卵巢癌中的表達量明顯下降(P0.01),提示RASSF8在EOC中可能起到抑癌作用。2.RASSF8可以抑制卵巢癌細胞的增殖、侵襲和遷移。與陰性對照組相比,下調RASSF8可以促進SKOV3細胞的增殖能力,侵襲和遷移細胞數目均高于對照組。3.RASSF8可能通過調控NF-κB信號通路發(fā)揮抑癌作用。結果顯示:與對照組相比,下調RASSF8后,P65和p-P65的表達增加,而IκBα表達會下降,差異有統(tǒng)計學意義。結論RASSF8在上皮性卵巢癌中起到抑癌作用,并可能通過調控NF-κB信號通路發(fā)揮作用。
【圖文】：

１．２采用ｑＲＴ－ｑＰＣＲ對２０對ＥＯＣ組織和鄰近正常卵巢組織中ｍｉＲ－３２０ａ的表逡逑達進行檢測。結果顯示，ｍｉＲ－３２０ａ在卵巢癌組織中的表達水平要高于癌旁正常逡逑卵巢組織，差異有統(tǒng)計學意義（Ｐ＜０．０１；圖１）。逡逑＾邐２．５ｉ逡逑0邐＊＊逡逑２邐２．０－邐—｜—逡逑§邐１－５－逡逑（／）逡逑０逡逑９－邋１．０－邐逡逑①逡逑？＾３邐０．５￣逡逑ＣＵ逡逑０）逡逑＾邋0．0Ｊ邐邐１邐邐邐１邐—逡逑Ｎｏｒｍａｌ（Ｎ＝２０）邐Ｃａｎｃｅｒ（Ｎ＝２０）逡逑圖１邋．ｍｉＲ－３２０ａ在２０對ＥＯＣ組織和鄰近正常卵巢組織中的表達（Ａｌ＞＜０．０１）逡逑１．３此外，與正常卵巢細胞系相比，三種Ｂ３Ｃ細胞系中ｍｉＲ－３２０ａ的表達水逡逑平較高（圖２），上述所有結果提示ｍｉＲ－３２０ａ在ＥＯＣ組織及細胞系中表達上調，逡逑４１逡逑

圖１邋．ｍｉＲ－３２０ａ在２０對ＥＯＣ組織和鄰近正常卵巢組織中的表達（Ａｌ＞＜０．０１）逡逑１．３此外，與正常卵巢細胞系相比，三種Ｂ３Ｃ細胞系中ｍｉＲ－３２０ａ的表達水逡逑平較高（圖２），，上述所有結果提示ｍｉＲ－３２０ａ在ＥＯＣ組織及細胞系中表達上調，逡逑４１逡逑
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R737.31

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