【摘要】：【目的】AZD1775促進(jìn)有絲分裂并通過強(qiáng)制細(xì)胞連續(xù)的進(jìn)入復(fù)制周期來增加基因組的不穩(wěn)定性,最終導(dǎo)致有絲分裂災(zāi)難引起細(xì)胞凋亡。然而,目前尚未有AZD1775對免疫微環(huán)境的影響的研究。本研究主要目的為闡釋AZD1775上調(diào)卵巢癌細(xì)胞PD-L1的機(jī)制及其聯(lián)合αPD-L1治療卵巢癌的潛在價(jià)值�！痉椒ā緾CK8檢測了AZD1775對一系列卵巢癌細(xì)胞的毒性作用。流式檢測了AZD1775對細(xì)胞周期的影響。免疫熒光,彗星實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)用于檢測AZD1775對腫瘤細(xì)胞的DNA損傷作用。通過實(shí)時(shí)定量熒光PCR技術(shù)(q PCR)及蛋白印跡實(shí)驗(yàn)(Western Blot,WB)檢測AZD1775處理后ID8細(xì)胞,OV2008細(xì)胞和C13細(xì)胞PD-L1表達(dá)變化。AZD1775處理后ID8細(xì)胞的RNAseq數(shù)據(jù)用于機(jī)制探究。通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測AZD1775處理后ID8細(xì)胞,OV2008細(xì)胞和C13細(xì)胞干擾素表達(dá)變化,q PCR及WB檢測DNMT1及干擾素信號通路活化相關(guān)基因改變,免疫熒光檢測ds RNA表達(dá)改變來驗(yàn)證AZD1775上調(diào)PD-L1表達(dá)的機(jī)制。ID8移植瘤模型用以評估AZD1775聯(lián)合αPD-L1治療卵巢癌的效果。流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠腫瘤組織內(nèi)免疫細(xì)胞成分變化。The Cancer Genome Atlas(TCGA)數(shù)據(jù)庫用于驗(yàn)證基于病毒防御反應(yīng)相關(guān)基因構(gòu)建的signature對免疫檢查點(diǎn)治療反應(yīng)預(yù)測的準(zhǔn)確性【結(jié)果】我們證實(shí)了AZD1775在卵巢癌細(xì)胞中的周期調(diào)控和DNA損傷作用。同時(shí),我們發(fā)現(xiàn)AZD1775能夠明顯上調(diào)卵巢癌細(xì)胞PD-L1的表達(dá)。RNAseq數(shù)據(jù)的GSEA分析發(fā)現(xiàn),AZD1775處理后干擾素信號通路明顯富集。AZD1775處理后各型干擾素均有一定程度的分泌,其中變化最顯著的是三型干擾素。AZD1775通過ds RNA導(dǎo)致干擾素分泌升高。同時(shí),我們也發(fā)現(xiàn)AZD1775能夠下調(diào)DNMT1的表達(dá)介導(dǎo)了內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(ERVs)基因的表觀調(diào)控,進(jìn)而影響了其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物ds RNA的表達(dá)。AZD1775下調(diào)E2F通路使DNMT1表達(dá)下降。動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AZD1775與αPD-L1聯(lián)合治療的效果好于單獨(dú)使用AZD1775。此外,流式檢測腫瘤組織內(nèi)免疫細(xì)胞成分,發(fā)現(xiàn)AZD1775處理后腫瘤組織內(nèi)T淋巴細(xì)胞比例增加,主要為CD8+T細(xì)胞,Treg細(xì)胞比例下降,CD8+/Treg比例明顯增加。我們利用TCGA數(shù)據(jù)庫RNAseq數(shù)據(jù)對WEE1基因同CD3e,CD4,CD8a,CD68,DNMT1,STAT1作相關(guān)性分析。我們發(fā)現(xiàn)WEE1表達(dá)同CD3e,CD8a,CD68表達(dá)呈負(fù)相關(guān),與DNMT1的表達(dá)呈正相關(guān)。我們基于病毒防御反應(yīng)基因構(gòu)建的Signature與TCGA數(shù)據(jù)庫中的卵巢癌數(shù)據(jù)進(jìn)行對比,發(fā)現(xiàn)該Signature與卵巢癌“免疫反應(yīng)型”的結(jié)果非常吻合�！窘Y(jié)論】我們的研究闡釋了AZD1775上調(diào)卵巢癌細(xì)胞PD-L1表達(dá)的機(jī)制,描述了其聯(lián)合應(yīng)用αPD-L1的治療效果。不但補(bǔ)充了AZD1775在腫瘤免疫微環(huán)境中的作用,更重要的是有助于探索更精準(zhǔn)的小分子靶向治療聯(lián)合免疫治療的治療模式,為改善卵巢癌預(yù)后開辟一個新的方向。
【圖文】：

25 1.AZD1775 在 9 株卵巢癌細(xì)胞系中的 IC50。9 株卵巢癌細(xì)胞系（C13，OV2008，ID8，Cao90，，OVCAR3，SKOV3，TOV-21G，ES2），給予不同濃度梯度的 AZD1775 處理 48 小時(shí)，CC測存活細(xì)胞比例，計(jì)算每種細(xì)胞系的 IC50。為了檢測 AZD1775 對卵巢癌細(xì)胞的殺傷效果，我們選取了 9 株卵巢癌細(xì)胞C13，OV2008，ID8，Caov3，OV90，OVCAR3，SKOV3，TOV-21G，ES2），給同濃度梯度的 AZD1775 處理 48 小時(shí)，CCK8 檢測存活細(xì)胞比例（圖 1）。我們發(fā)

C13（IC50 =3 23.8nM），OV2008（IC50 = 458.7nM），OVCAR3（IC50 = 590.6nM），SKOV3（IC50 = 770.4nM），TOV-21G（IC50 = 346.1nM），ES-2（IC50 = 285.3nM）對 AZD1775 相對敏感，而 ID8（IC50 = 14.295μM），Caov3（IC50 = 1.911μM），OV90（IC50 = 2.463μM）相對耐藥。我們選取了兩株人源性卵巢癌細(xì)胞系 C13，OV2008和一株鼠源性卵巢癌細(xì)胞系 ID8 作為后續(xù)研究細(xì)胞株。DNA 損傷時(shí)，WEE1 可在 G2/M 期檢測點(diǎn)阻斷細(xì)胞有絲分裂，進(jìn)行 DNA 損傷修復(fù)。AZD1775 通過與 WEE1 結(jié)合而抑制性的磷酸化 CDK1（CDC2），進(jìn)而腫瘤細(xì)胞損傷 DNA 累積，導(dǎo)致染色體丟失，細(xì)胞凋亡，稱為“有絲分裂災(zāi)難”。C13，OV2008和 ID8 三株卵巢癌細(xì)胞系用 AZD1775（800nM）處理 24 小時(shí)后，流式檢測細(xì)胞系周期變化。我們發(fā)現(xiàn)，相對于對照組，AZD1775 處理組破壞了 G2/M 期的檢查點(diǎn)阻滯，導(dǎo)致細(xì)胞過早進(jìn)入 M 期，G2/M 期比例升高。AZD1775 處理 24 小時(shí)后，C13 G2/M 期細(xì)胞比例由 17.8%升高到 25.8%，OV2008 G2/M 期細(xì)胞比例由 18.8%升高到 26.8%，ID8 G2/M 期細(xì)胞比例則由 9.75%升高到 17.7%（圖 2）。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R737.31

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本文編號：2658998