發(fā)布時間：2020-05-05 04:22

【摘要】：目的:胚胎著床取決于具有活性的胚胎和容受態(tài)子宮之間相互作用,此過程中伴隨著母體子宮內(nèi)膜蛻膜化發(fā)生。早孕小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化是小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞增殖、分化為一種特殊的蛻膜細胞的過程,在胎盤形成以前為胚胎發(fā)育提供支持和營養(yǎng)。FOXO3a(Forkhead box O3a)是一種高度保守的轉(zhuǎn)錄因子,參與細胞生長、增殖、分化等多種生理過程。研究發(fā)現(xiàn)FOXO3a在多種組織器官及細胞增殖分化過程中發(fā)揮了重要作用,但在子宮內(nèi)膜蛻膜化過程中的作用尚不明確。因此,本文旨在研究FOXO3a在早孕小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化過程中的作用及可能機制。方法:1.構(gòu)建小鼠正常妊娠模型及假孕模型,采用Western blot、免疫組化檢測小鼠子宮內(nèi)膜FOXO3a的表達規(guī)律。2.構(gòu)建小鼠體內(nèi)人工誘導(dǎo)蛻膜化模型及體外原代子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞蛻膜化誘導(dǎo)模型,采用Western blot、免疫組化、免疫熒光、RT-PCR檢測體內(nèi)外人工誘導(dǎo)蛻膜化后FOXO3a的表達情況。在上述模型中采用FOXO3a-siRNA干擾后進一步檢測蛻膜化標志分子的表達,以探討干擾FOXO3a表達是否影響子宮內(nèi)膜蛻膜化。3.構(gòu)建FOXO3a-siRNA干擾的小鼠體內(nèi)人工誘導(dǎo)蛻膜化模型及體外原代子宮基質(zhì)細胞蛻膜化誘導(dǎo)模型,采用Western blot、免疫組化、RT-PCR、流式細胞術(shù)等檢測細胞增殖、凋亡情況,初步探討FOXO3調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜蛻膜化是否與細胞增殖、凋亡有關(guān)。4.構(gòu)建FOXO3a-siRNA干擾的小鼠正常妊娠模型,觀察早孕小鼠孕第7天的子宮形態(tài)及胚胎著床情況,并采用各種分子生物學(xué)方法檢測蛻膜化標志分子的表達以及細胞增殖、凋亡情況,利用體內(nèi)正常妊娠模型再次驗證FOXO3a對早孕小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果:1.Western blot和免疫組化檢測結(jié)果顯示,與孕第1天相比較,FOXO3a在早孕小鼠孕第4-7天表達明顯升高,且在著床點子宮內(nèi)膜處的表達顯著高于相同孕天著床旁子宮內(nèi)膜。著床點處FOXO3a的表達主要定位于子宮基質(zhì)細胞和腺上皮細胞。假孕模型檢測結(jié)果顯示,與假孕第1天相比較,假孕第6天FOXO3a的表達也顯著增加。2.體內(nèi)外人工誘導(dǎo)蛻膜化模型檢測結(jié)果均顯示蛻膜化誘導(dǎo)后FOXO3a表達顯著上調(diào)。FOXO3a-siRNA干擾后小鼠蛻膜化誘導(dǎo)側(cè)子宮腫脹程度不足,蛻膜化標志分子ALPL表達顯著下調(diào)。與體內(nèi)結(jié)果一致,將FOXO3a-siRNA體外轉(zhuǎn)染原代小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞后,蛻膜化誘導(dǎo)受損,蛻膜化標志分子MMP9、BMP2、MMP2表達顯著下調(diào),增殖相關(guān)蛋白Ki67和PCNA表達顯著上調(diào),凋亡相關(guān)蛋白PARP、Bax、Caspase 3、Cleaved Caspase 3、Bcl-2、Fas顯著下調(diào)。3.FOXO3a-siRNA干擾后,妊娠小鼠孕7天子宮著床胚胎數(shù)量顯著減少。進一步檢測發(fā)現(xiàn),蛻膜化標志分子BMP2表達顯著下調(diào),增殖相關(guān)蛋白Ki67、PCNA表達明顯上調(diào),凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Fas表達明顯降低,流式細胞術(shù)檢測顯示細胞凋亡顯著下調(diào)。結(jié)論:FOXO3a可能參與調(diào)控早孕小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化,且這一作用可能與細胞增殖、凋亡有關(guān)。
【圖文】：

3.1 FOXO3a 在正常妊娠模型和假孕模型小鼠子宮內(nèi)膜中的表達規(guī)律采用 Western blot 檢測小鼠正常妊娠 D1-D7 天子宮內(nèi)膜 FOXO3a 的表達，結(jié)果顯示：FOXO3a 在正常妊娠 D4-D7 天的表達明顯高于妊娠 D1 天(圖 1A、C)。為排除胚胎信號的干擾，進一步在假孕模型中采用 Western blot 檢測了子宮內(nèi)膜FOXO3a 的表達。結(jié)果顯示：與假孕 PD1 相比較，假孕 PD4- PD7 天的表達均顯著增加，并于假孕 PD6 天表達最高(圖 1B、D)。我們同時采用免疫組化檢測了 FOXO3a 在早孕小鼠著床點和著床旁子宮內(nèi)膜中的表達情況。結(jié)果顯示：FOXO3a 在著床點子宮腺上皮、腔上皮和胚胎均有明顯表達，，隨著天數(shù)的增加，F(xiàn)OXO3a 從初級蛻膜區(qū)逐漸擴散至次級蛻膜區(qū)(圖2A)。此外，免疫組化和 Western blot 結(jié)果均顯示 FOXO3a 在妊娠 D5-D7 天子宮著床點的表達明顯高于著床旁(圖 2)。

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文Fig. 1 Expression of FOXO3a in uterine endometrium of normal pregnancy andpseudopregnancy model.A: Western blot analysis of FOXO3a on Days 1 7 of pregnancy. B: Expression of FOXO3aon Days 1 7 of pseudopregnancy. C: Histogram showing the quantification of the results forA. D: Histogram showing the quantification of the results for B. *P< 0.05, **P < 0.01, ***P <0.001.
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R714

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本文編號：2649535