發(fā)布時間：2020-04-20 11:06

【摘要】：研究背景壓力性尿失禁(Stress Urinary Incontinence,SUI)是好發(fā)于孕產(chǎn)婦及中、老年婦女的慢性病,嚴重影響患者生活質(zhì)量,被稱為“社交癌”。近年來,隨著二胎政策開放和人口老齡化,SUI患者數(shù)劇增,引起醫(yī)學界重視;但該病發(fā)病機制欠清,缺乏理想的臨床防治措施�，F(xiàn)已公認,SUI主要由尿道支撐組織薄弱所致;進一步研究認為,成纖維細胞主導的尿道支撐組織微環(huán)境細胞外基質(zhì)(Extra-cellular Matrix,ECM)重構(gòu)障礙是該病發(fā)病的關(guān)鍵,但其具體調(diào)控機理尚未明確。外泌體是近年來備受關(guān)注的胞間通訊方式,參與多種組織局灶ECM微環(huán)境結(jié)構(gòu)及功能調(diào)控;通過探討外泌體在尿道支撐組織中的表達及其在SUI發(fā)病中的作用,有望為該病發(fā)病機制研究提供可行方向;然而,國內(nèi)外文獻罕見相關(guān)報道。目的本研究旨在明確尿道支撐組織局灶微環(huán)境中是否存在外泌體調(diào)控方式;闡明SUI患者是否存在尿道支撐組織外泌體異常表達;并在體外細胞水平,探討該外泌體對尿道支撐組織成纖維細胞功能的影響。研究方法1.收集女性尿道支撐組織,分為SUI組和非SUI組,每組各8例;匹配兩組間年齡、絕經(jīng)時間、孕產(chǎn)次、分娩方式及體重指數(shù)(Body Mass Index,BMI)。2.采用沉淀法提取尿道支撐組織來源外泌體,聯(lián)合電鏡、納米顆粒示蹤分析技術(shù)及蛋白免疫印跡法,鑒定其形態(tài)特征、粒徑分布范圍及外泌體標志蛋白CD63的表達。3.采用納米顆粒示蹤分析技術(shù)及BCA蛋白定量法,檢測SUI組和非SUI組尿道支撐組織來源外泌體含量,比較組間差異。4.獲得女性尿道支撐組織原代成纖維細胞,共培養(yǎng)細胞與尿道支撐組織來源外泌體,分為F+Sexo組(成纖維細胞與SUI組尿道支撐組織來源外泌體共培養(yǎng))、F+Nexo組(成纖維細胞與非SUI組尿道支撐組織來源外泌體共培養(yǎng))和F組(即對照組,成纖維細胞與培養(yǎng)基共培養(yǎng)),采用CCK-8增殖實驗、劃痕實驗、蛋白免疫印跡法及反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈鎖反應(yīng)法,觀察各組成纖維細胞增殖、遷移和膠原合成功能,比較組間差異。研究結(jié)果1.女性尿道支撐組織中提取到沉淀物質(zhì),透射電鏡顯示其形態(tài)為類圓形杯口狀,蛋白免疫印跡法顯示其外泌體特異性標志蛋白CD63表達呈現(xiàn)陽性結(jié)果,納米顆粒示蹤分析技術(shù)顯示其直徑主要分布于50-200nm區(qū)間,鑒定為外泌體。2.SUI組和非SUI組單位質(zhì)量(g)尿道支撐組織來源外泌體蛋白含量分別為1606.02 ug 和 1216.75 ug,外泌體數(shù)量分別為 2219x10^8 個和 982 x10^8 個,SUI組外泌體蛋白含量和數(shù)量均顯著高于非SUI組(p均0.05)。3.F+Sexo組成纖維細胞在24h、48h及72h時間點細胞的增殖率分別為30%、52%及 214%,F+Nexo 組分別為 16%、32%及 105%;F+Sexo 組和 F+Nexo 組各時段細胞OD值均較對照組顯著增加(p均0.05),F+Sexo組各時段細胞OD值顯著高于 F+Nexo 組(p均0.05)。4.24h、48h及72h的細胞劃痕愈合率F+Sexo組分別為19%、26%及27%,F+Nexo組分別為38%、61%及77%,對照組分別為59%、100%及100%;經(jīng)統(tǒng)計學分析,F+Sexo組和F+Nexo組各時段細胞劃痕愈合率均顯著低于對照組(p均0.05),F+Sexo組各時段細胞劃痕愈合率均顯著低于F+Nexo組(p均0.05)。5.F+Sexo組細胞Ⅰ型和Ⅲ型前膠原mRNA及蛋白表達水平顯著高于對照組(p均0.05);F+Nexo組細胞Ⅰ型和Ⅲ型前膠原的mRNA和蛋白水平與對照組相比無統(tǒng)計學差異。結(jié)論1.尿道支撐組織局灶微環(huán)境存在外泌體調(diào)控方式。2.SUI組尿道支撐組織外泌體的表達量顯著高于非SUI組。3.尿道支撐組織來源外泌體可能通過影響成纖維細胞增殖、遷移及膠原合成能力參與SUI發(fā)病。
【圖文】：

３．２尿道支撐組織來源外泌體的提取及鑒定逡逑采用ＳＢ１沉淀技術(shù)從原代尿道支撐組織中成功提取沉淀物，透射電鏡觀察顯示逡逑沉淀物形態(tài)為類圓形杯口狀（圖１Ａ），Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ法顯示沉淀物外泌體特異性標逡逑志蛋白ＣＤ６３呈現(xiàn)陽性表達（圖１Ｂ），納米顆粒示蹤技術(shù)顯示沉淀物直徑主要分逡逑布于５０－２００ｎｍ間（圖１Ｃ－Ｅ）。以上三種方法結(jié)合，證實女性尿道支撐組織中存逡逑在外泌體分布。逡逑２１逡逑

學碩士學位論文質(zhì)量（ｇ）尿道支撐組織外泌體總蛋白量均值為１６０６．０２邋ｕｇ，非ＳＵＩｇ）尿道支撐組織外泌體總蛋白量均值為１２１６．７５邋ｕｇ；經(jīng)Ｔ檢驗，兩計學意義，ＳＵＩ組尿道支撐組織來源外泌體蛋白含量顯著高于非．０５，，圖邋２Ｄ）。逡逑Ａ邐Ｃ逡逑
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R711.59

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本文編號：2634475