【摘要】：目的研究并闡明妊娠期鎘暴露對(duì)F1代大鼠成年后卵巢顆粒細(xì)胞生長(zhǎng)和激素合成功能的影響及其DNA甲基化模式改變,為進(jìn)一步闡明鎘致卵巢細(xì)顆粒細(xì)胞胞損傷及其表遺傳機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。方法SPF級(jí)成年SD大鼠,合籠受孕后,于妊娠第1-20天分別暴露于0、0.5、2.0、8mg/kg CdCl2,灌胃染毒,每天一次。F1代雌鼠于出生后第56天時(shí),取卵巢顆粒細(xì)胞穩(wěn)定培養(yǎng)24h貼壁后收集細(xì)胞(10×10~6個(gè)/ml)及上清液備用。第一部分妊娠期鎘暴露致F1代大鼠成年后顆粒細(xì)胞凋亡的影響(1)觀察顆粒細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)(透射電子顯微鏡);(2)檢測(cè)卵巢顆粒細(xì)胞凋亡率(AnnexinV-FITC/PI雙染);(3)檢測(cè)卵巢顆粒細(xì)胞Bcl-2、Bax、Bcl-xl、Caspase3、及Caspase8基因mRNA(RT-PCR法)和蛋白表達(dá)(Western-blot法)。第二部分妊娠期鎘暴露致F1代大鼠成年后顆粒細(xì)胞激素合成的影響(1)檢測(cè)顆粒細(xì)胞上清液孕酮、雌二醇水平(ELISA法);(2)檢測(cè)顆粒細(xì)胞StAR、SF-1、Cyp11a1、Cyp17a1及Cyp19 a1基因mRNA(RT-PCR法)和蛋白表達(dá)(Western-blot法)第三部分F1代大鼠成年后顆粒細(xì)胞全基因組DNA啟動(dòng)子區(qū)甲基化研究(1)檢測(cè)卵巢顆粒細(xì)胞(n=3)全基因組DNA甲基化啟動(dòng)子區(qū)差異基因表達(dá)譜(免疫共沉淀法);(2)差異甲基化基因GO分析;(3)差異甲基化基因KEGG信號(hào)通路分析。第四部分:根據(jù)芯片檢測(cè)結(jié)果及生物信息學(xué)分析提示驗(yàn)證Eif2s1、Atf4啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化狀態(tài)(1)啟動(dòng)子在線分析軟件Methl Primer Express及SignalMap確定Eif2s1、Atf4基因啟動(dòng)子區(qū)差異峰落在CpG島;(2)驗(yàn)證Eif2s1、Atf4基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)(BSP法);(3)測(cè)定Eif2s1、Atf基因的mRNA表達(dá)水平(RT-PCR)。結(jié)果第一部分:妊娠期鎘暴露致F1代大鼠成年后顆粒細(xì)胞凋亡的影響(1)與對(duì)照組相比,各染鎘組出現(xiàn)的凋亡細(xì)胞及凋亡小體數(shù)量增加,顆粒細(xì)胞線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞核、染色質(zhì)出現(xiàn)不同程度損傷。(2)與對(duì)照組比,各染鎘組凋亡率均升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。(3)與對(duì)照組相比,各染鎘組Bcl-2、Bcl-xl及Bcl-2/Bax mRNA和蛋白表達(dá)均出現(xiàn)不同程度的下調(diào),Caspase3基因mRNA差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,蛋白表達(dá)出現(xiàn)不同程度上調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),各染鎘組Bax、Caspases8基因mRNA及蛋白表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第二部分:妊娠期鎘暴露致F1代大鼠成年后顆粒細(xì)胞激素合成的影響(1)與對(duì)照組相比,各染鎘組顆粒細(xì)胞上清孕酮水平顯著性下調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),而雌二醇水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(2)各染鎘組StAR、Cyp11a1基因mRNA及蛋白表達(dá)均顯著下調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),Cyp17a1、Cyp19a1基因mRNA及蛋白表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),SF-1基因mRNA表達(dá)出現(xiàn)不同程度改變,但蛋白差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。第三部分F1代大鼠成年后顆粒細(xì)胞全基因組DNA啟動(dòng)子區(qū)甲基化研究(1)與對(duì)照組相比,8.0mg/kg組基因組DNA發(fā)生低甲基化基因的數(shù)量高于發(fā)生高甲基化的基因數(shù),且主要發(fā)生在高密度啟動(dòng)子和中密度啟動(dòng)子區(qū)。(2)GO分析提示妊娠鎘暴露對(duì)F1代大鼠成年后卵巢顆粒細(xì)胞相應(yīng)的生物學(xué)過程、分子功能及細(xì)胞組分產(chǎn)生影響。(3)差異性甲基化Pathway分析提示,與對(duì)照組相比,鎘暴露對(duì)F1代大鼠顆粒細(xì)胞48條通路產(chǎn)生影響,其中凋亡通路中Eif2s1、Atf4等14個(gè)基因啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生了高甲基化,Bcl-xl基因啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生低甲基化,未見Bcl-2、Bax、Caspase3、Caspase8基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)發(fā)生改變;激素合成基因Cyp1a1、Hsd17b1啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生低甲基化,未見StAR、SF-1、Cyp11a1、Cyp17a1、Cyp19a1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化發(fā)生改變。第四部分根據(jù)芯片檢測(cè)結(jié)果及生物信息學(xué)分析等結(jié)果提示驗(yàn)證Eif2s1、Atf4啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化狀態(tài)(1)Eif2s1、Atf4基因啟動(dòng)子特定區(qū)域出現(xiàn)高甲基化峰,此峰落在相應(yīng)基因CpG島。(2)與對(duì)照組相比,各染鎘組Eif2s1、Atf4基因mRNA表達(dá)下調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(3)與對(duì)照組相比,8.0mg/kg組Eif2s1基因啟動(dòng)子區(qū)平均甲基化率增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),Atf4基因啟動(dòng)子區(qū)平均甲基化率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論根據(jù)以上結(jié)果,可得出如下結(jié)論1.妊娠期鎘暴露可致F1代大鼠成年后卵巢顆粒細(xì)胞生長(zhǎng)和功能產(chǎn)生影響。2.妊娠期鎘暴會(huì)改變F1代大鼠成年后顆粒細(xì)胞全基因組DNA甲基化狀態(tài),引起凋亡及激素合成相關(guān)基因甲基化模式發(fā)生改變。3.本實(shí)驗(yàn)條件下Eif2s1--Atf4通路被抑制,DNA甲基化可能參與其抑制Eif2s1基因mRNA表達(dá)的調(diào)控,但可能未參與其抑制Atf4基因mRNA表達(dá)的調(diào)控。
【圖文】：

結(jié)果第一部分 妊娠期鎘暴露致 F1 代卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的影響1 透射電子顯微鏡觀察 F1 代大鼠卵巢顆粒細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)使用透射電鏡對(duì)不同劑量體外鎘暴露后大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的亞顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示：如圖 1.1 A 所示，對(duì)照組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞膜完整，細(xì)胞核核膜清楚，核染色質(zhì)分布均勻，，未見異染色質(zhì)，線粒體豐富，其結(jié)構(gòu)及線粒體清楚完整；如圖 1.1B 所示，可見兩個(gè)凋亡小體，凋亡小體，凋亡小體內(nèi)線粒體脹，嵴稀疏；如圖 1.1C 所示，細(xì)胞體積變小，細(xì)胞質(zhì)濃縮，細(xì)胞核邊集，染色固縮；如圖 1.1D 所示，細(xì)胞體積變小，核分裂，線粒體腫脹，線粒體嵴消失，亡小體。A B

2 妊娠期鎘暴露致 F1代大鼠成年后顆粒細(xì)胞激素合成的影響Annexin V-FITC/PI 雙染法對(duì)各組 F1代大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)。如圖1.2 A 所示，0、0.5、2.0和8.0 mg/ kg 大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡率分別為11.35%，19.28%，22.41%，19.65%；如圖1.2 B 和表1.1所示，與對(duì)照組比較，0.5、2.0和8.0 mg/ kg 細(xì)胞凋亡率差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＜0.01)。A0mg/kg 0.5mg/kg2.0mg/kg 8.0mg/kg
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R715.3

【參考文獻(xiàn)】

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1 賈廣樂;王眾;吳紹強(qiáng);林祥梅;韓雪清;劉建;梅琳;張e

本文編號(hào)：2632768