【摘要】：背景子宮頸癌是全球女性中常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。目前治療宮頸癌方法主要包括手術(shù)和放化療,但都未達(dá)到理想的治療效果,尤其是宮頸癌中晚期患者,預(yù)后較差。p53作為一種最常見(jiàn)的抑癌基因,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用,由于其在子宮頸癌組織中表達(dá)水平較低,使得p53基因在子宮頸癌的基因治療方面有著重要的潛力。因此,利用轉(zhuǎn)入技術(shù)將高表達(dá)抑癌基因p53結(jié)合傳統(tǒng)化療方法極有可能在宮頸癌的治療中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。羥喜樹(shù)堿(hydroxycamptothecin,HCPT)作為一種植物類抗癌藥物已廣泛應(yīng)用于胃癌、肝癌、骨肉瘤等許多惡性腫瘤的治療中,療效較好,但羥喜樹(shù)堿對(duì)宮頸癌的抑制作用研究較少。如果將兩者結(jié)合,可能會(huì)明顯提高宮頸癌的治療效率,從而為臨床上宮頸癌的治療提供新的研究方向。目的將外源野生型p53基因?qū)雽m頸癌HeLa、SiHa細(xì)胞中,探討HCPT對(duì)已經(jīng)轉(zhuǎn)染外源野生型p53基因的宮頸癌細(xì)胞體外生長(zhǎng)、凋亡作用的影響。方法1.細(xì)胞培養(yǎng)常規(guī)將宮頸癌HeLa、SiHa細(xì)胞復(fù)蘇和培養(yǎng)。2.轉(zhuǎn)染將宮頸癌細(xì)胞分為3組:(1)空白對(duì)照組,即正常培養(yǎng)的宮頸癌HeLa、SiHa細(xì)胞;(2)陰性對(duì)照組,即將空質(zhì)粒導(dǎo)入宮頸癌HeLa、SiHa細(xì)胞;(3)實(shí)驗(yàn)組,即將攜帶外源野生型p53基因的質(zhì)粒導(dǎo)入宮頸癌HeLa、SiHa細(xì)胞。3.檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率將轉(zhuǎn)染過(guò)的兩組細(xì)胞培養(yǎng)48h后,采用熒光顯微鏡通過(guò)藍(lán)光激發(fā)綠光來(lái)觀察轉(zhuǎn)染效率。然后提取總RNA,并采用qRT-PCR檢測(cè)兩種細(xì)胞中p53的表達(dá)水平,以hACTB基因?yàn)閮?nèi)參,來(lái)驗(yàn)證p53基因轉(zhuǎn)染效率的高低。4.將HCPT加入各組細(xì)胞后,檢測(cè)宮頸癌細(xì)胞增殖率、凋亡率、及相關(guān)蛋白的表達(dá)量(1)采用CCK-8法檢測(cè)p53基因真核載體及陰性對(duì)照瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HeLa、SiHa細(xì)胞后,用不同濃度的HCPT處理轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞,未轉(zhuǎn)染正常細(xì)胞作為對(duì)照。(2)采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞凋亡率的變化。(3)應(yīng)用qRT-PCR法檢測(cè)p53、bax、bcl-2、MMP9、VEGF mRNA的表達(dá)。(4)應(yīng)用Western blot檢測(cè)p53、bax、bcl-2、MMP9、VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果1.熒光顯微鏡和qRT-PCR檢測(cè)顯示:導(dǎo)入宮頸癌中的p53目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率高,且轉(zhuǎn)染后p53 mRNA表達(dá)水平顯著提高。2.CCK-8結(jié)果顯示:不同濃度HCPT處理轉(zhuǎn)染后宮頸癌HeLa、SiHa細(xì)胞,兩種細(xì)胞抑制率會(huì)隨著HCPT濃度增加及作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng),與空白對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),說(shuō)明HCPT可抑制宮頸癌HeLa、SiHa細(xì)胞的增殖,且呈濃度和時(shí)間劑量依賴性。3.流式細(xì)胞技術(shù)結(jié)果顯示:HCPT組、p53組、p53聯(lián)合HCPT組與空白對(duì)照組比較,細(xì)胞凋亡率明顯增加,各組間兩兩比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4.qRT-PCR結(jié)果顯示:在轉(zhuǎn)染后的宮頸癌Hela、SiHa細(xì)胞中p53及bax mRNA表達(dá)是增高的,而bcl-2、VEGF mRNA表達(dá)是降低的,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5.Western-blot結(jié)果顯示:在宮頸癌Hela、SiHa細(xì)胞中p53及bax蛋白的相對(duì)表達(dá)量均增高,而bcl-2、VEGF的相對(duì)表達(dá)量是降低的,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論外源野生型p53基因?qū)雽m頸癌HeLa和SiHa細(xì)胞后,可明顯增強(qiáng)HCPT的作用,即抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖,促進(jìn)細(xì)胞的凋亡,減少細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。
【圖文】：

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)文論文2 結(jié) 果2.1 p53 基因?qū)雽m頸癌 HeLa、SiHa 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率2.1.1 熒光顯微鏡觀察瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 HeLa、SiHa 細(xì)胞的效率為了檢測(cè) p53 在宮頸癌 HeLa、SiHa 細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率，我們使用陽(yáng)離子脂質(zhì)體 Lipofectamin2000，轉(zhuǎn)染 HeLa 細(xì)胞 48h 后，在熒光顯微鏡下選用藍(lán)色激發(fā)波長(zhǎng)，觀察瞬時(shí)表達(dá)的感染細(xì)胞發(fā)綠色熒光。白光下觀察轉(zhuǎn)染目的質(zhì)粒的細(xì)胞形態(tài)改變明顯，體積變小，排列緊密，如(圖 1D)所示。轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒和目的質(zhì)粒的 HeLa細(xì)胞可觀察到綠色熒光表達(dá)量較多，排列較緊密，(圖 1A 和圖 1C)，說(shuō)明該實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染效率較好。

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)文論文圖 B 是白光下轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒 pcNDA3.1-HA-EGFP 48h 后 HeLa 細(xì)胞；圖 C 是熒光下轉(zhuǎn)染目的質(zhì)粒 pcNDA3.1-HA-TP53 48h 后 HeLa 細(xì)胞；圖 D 是白光下轉(zhuǎn)染目的質(zhì)粒 pcNDA3.1-HA-TP53 48h 后 HeLa 細(xì)胞。同樣使用陽(yáng)離子脂質(zhì)體 Lipofectamin2000，轉(zhuǎn)染 SiHa 細(xì)胞 48h 后，在熒光顯微鏡下選用藍(lán)色激發(fā)波長(zhǎng)，觀察瞬時(shí)表達(dá)效果。白光下觀察轉(zhuǎn)染目的質(zhì)粒的細(xì)胞形態(tài)改變明顯，體積變小，排列較緊密，如(圖 2D)所示。轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒和目的質(zhì)粒的 SiHa 細(xì)胞可觀察到綠色熒光表達(dá)量較 HeLa 細(xì)胞明顯減少，說(shuō)明該實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染效率明顯較 HeLa 細(xì)胞低，(圖 2A 和圖 2C)。
【學(xué)位授予單位】：新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R737.33

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2626279