【摘要】：紫杉醇(paclitaxe,PTX)聯(lián)合鉑類藥物為卵巢癌的一線化療方案�；熣T導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞信號(hào)通路激活與耐藥相關(guān)。對(duì)化療的敏感性與晚期卵巢癌患者生存期密切相關(guān)。因此,降低耐藥發(fā)生,提高化療敏感性對(duì)卵巢癌的治療十分重要。MicroRNAs是一類約含22個(gè)堿基的內(nèi)源性非編碼小RNA,參與許多信號(hào)通路分子的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。化療與基因治療的聯(lián)合將為卵巢癌的治療開拓新的途徑。研究目的本課題旨在通過(guò)納米載藥系統(tǒng),聯(lián)合PTX及microRNA-7(miR-7),減輕化療毒副作用,提高化療的敏感性。研究?jī)?nèi)容1.構(gòu)建共載PTX及miR-7的mPEG-PLGA-PLL納米粒(P/MNPs)并表征。2.探討P/MNPs在卵巢癌細(xì)胞中的攝取、轉(zhuǎn)染效率及療效,并探索miR-7增敏PTX的機(jī)制。3.探討P/MNPs在小鼠卵巢癌模型中的生物分布、療效及轉(zhuǎn)染效率,并驗(yàn)證miR-7增敏PTX的機(jī)制。研究方法采用復(fù)乳法制備共載PTX及miR-7的mPEG-PLGA-PLL納米粒(P/MNPs),用正交實(shí)驗(yàn)探索優(yōu)化制備條件及PTX比例。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳探索miR-7的適宜比例。利用粒度儀對(duì)納米粒的粒徑及電位進(jìn)行測(cè)定,透射電鏡觀察納米粒形態(tài)。高效液相色譜分析測(cè)定PTX濃度,熒光分光光度計(jì)測(cè)定miR-7濃度。采用離心法分離檢測(cè)PTX包封率,透析法模擬PTX釋放,采用超濾離心法分離檢測(cè)miR-7包封率及釋放。采用CCK-8法測(cè)定納米粒毒性及IC_(50)值,通過(guò)熒光顯微鏡觀察細(xì)胞對(duì)納米粒的攝取,應(yīng)用溶酶體染料觀察納米粒的溶酶體逃逸,qRT-PCR檢測(cè)miR-7的轉(zhuǎn)染效率,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡比例。采用Western blot方法檢測(cè)經(jīng)PTX處理后卵巢癌細(xì)胞的耐藥蛋白及重要信號(hào)通路的蛋白表達(dá)變化,并探索miR-7增加PTX敏感性的作用機(jī)制。構(gòu)建裸鼠卵巢癌皮下異種移植瘤模型,小動(dòng)物活體成像儀觀察納米粒的生物學(xué)分布,冰凍切片檢測(cè)瘤體內(nèi)納米粒分布。應(yīng)用小鼠卵巢癌皮下瘤模型研究P/MNPs的療效,監(jiān)測(cè)腫瘤大小及體重變化,收集小鼠全血及血清進(jìn)行血常規(guī)及肝腎功能檢查,采用HE染色對(duì)小鼠心肝脾肺腎臟器進(jìn)行病理形態(tài)觀察。通過(guò)TUNEL實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腫瘤內(nèi)的細(xì)胞凋亡比例,qRT-PCR檢腫瘤內(nèi)miR-7的表達(dá)水平,采用免疫組化法檢測(cè)腫瘤EGFR蛋白表達(dá)變化。研究結(jié)果經(jīng)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化P/MNPs的制作工藝后,納米粒粒徑為105.0±0.86 nm,分散系數(shù)(Polydispersity index,PDI)為0.276±0.007,Zeta電位為19.0±2.04 mV,紫杉醇的包封率為84.1±1.31%,miR-7的包封率為98.3±0.21%。納米粒形態(tài)呈圓形,分散較好,在血清中對(duì)RNA有保護(hù)作用。P/MNPs中PTX及miR-7具有緩釋特性,前24h內(nèi)以PTX釋放為主,24h以后miR-7開始加速釋放,兩種藥物的釋放存在一定的時(shí)間差,持續(xù)釋放72h以上�？蛰dmPEG-PLGA-PLL納米粒無(wú)明顯細(xì)胞毒性。納米粒相比游離藥物能更好的被細(xì)胞攝取,并呈時(shí)間依賴性。納米粒被攝取后能夠從溶酶體中逃逸發(fā)揮作用。納米粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞24及48h后,能夠?qū)⒓?xì)胞內(nèi)miR-7水平分別提高15倍及40倍以上。P/MNPs的IC_(50)相比游離藥物明顯降低,48h的IC_(50)為2.85±0.45 ng/mL,72h的IC_(50)為0.41±0.03 ng/mL。P/MNPs誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力明顯增強(qiáng),48h及72h細(xì)胞的凋亡比例分別為45.4±1.17%及72.7±2.99%。Western blot結(jié)果顯示PTX可能引起卵巢癌細(xì)胞EGFR、ERK、p-ERK蛋白的表達(dá)增加,miR-7可抑制EGFR、ERK、p-ERK蛋白表達(dá)。動(dòng)物活體成像的結(jié)果提示游離藥物難以靶向腫瘤部位,P/MNPs能夠在2-8h內(nèi)聚集于腫瘤部位,并于24h達(dá)到高峰。瘤體冰凍切片顯示納米粒能夠成功的將兩種藥物同時(shí)運(yùn)載至腫瘤部位。體內(nèi)療效實(shí)驗(yàn)顯示P/MNPs組皮下瘤體平均重量為82.3±10.1 mg,相同用藥濃度下療效最好。毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示P/MNPs組小鼠的白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞數(shù)量相比游離藥物組有恢復(fù),且肝功能中ALT及AST也有所下降。P/MNPs組小鼠心肝脾肺腎臟器HE染色未見明顯病理改變。小鼠腫瘤TUNEL實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,P/MNPs組平均凋亡比例為10.7±1.87%,與游離藥物組及單藥納米粒組差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。瘤體qRT-PCR結(jié)果顯示,P/MNPs組的miR-7表達(dá)平均增加了21.2±6.76倍,與游離藥物組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。瘤體免疫組化的結(jié)果提示,游離PTX組的EGFR蛋白表達(dá)明顯增加,P/MNPs組的EGFR蛋白表達(dá)明顯減少,表明miR-7能抑制EGFR的表達(dá)。結(jié)論成功制備的共載PTX及miR-7的mPEG-PLGA-PLL納米載藥遞送系統(tǒng)(P/MNPs)粒徑適宜,分散均勻,能保護(hù)RNA不被降解,易于被細(xì)胞攝取,緩慢釋放,高效將miR-7轉(zhuǎn)入細(xì)胞,抑制由于PTX而被激活的與耐藥相關(guān)的EGFR/ERK通路,增加腫瘤細(xì)胞對(duì)PTX的敏感性。P/MNPs在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中能通過(guò)EPR效應(yīng)靶向腫瘤部位,增加腫瘤miR-7表達(dá),抑制EGFR表達(dá),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡,增強(qiáng)化療藥物抑瘤效果,并且無(wú)明顯的毒副作用,在卵巢癌治療中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
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上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院博士學(xué)位論文5圖1 共載紫杉醇及miR-7的mPEG-PLGA-PLL納米載藥遞送系統(tǒng)作用機(jī)制示意圖Figure1 A schematic diagram explaining the mechanism of mPEG-PLGA-PLL nanoparticles co-delivered with paclitaxel and microRNA-7本課題的研究?jī)?nèi)容主要包括以下三個(gè)部分：第一部分，，構(gòu)建共載紫杉醇及miR-7的mPEG-PLGA-PLL納米粒。探究紫杉醇、miR-7與材料mPEG-PLGA-PLL的適當(dāng)比例，優(yōu)化納米粒制作工藝。對(duì)納米粒進(jìn)行粒徑大小、電荷、形態(tài)的表征，對(duì)藥物的釋放進(jìn)行評(píng)估。第二部分，將成功構(gòu)建的共載紫杉醇及miR-7的mPEG-PLGA-PLL納米粒作用于卵巢癌細(xì)胞。檢測(cè)空載納米粒的細(xì)胞毒性、卵巢癌細(xì)胞對(duì)納米粒的攝取、納米粒的轉(zhuǎn)染效率以及對(duì)紫杉醇的增敏效果。探索紫杉醇作用于卵巢癌細(xì)胞后細(xì)胞通路的改變，探究miR-7增加PTX敏感性的機(jī)制。第三部分，在第二部分的研究基礎(chǔ)上進(jìn)行小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。利用小鼠卵巢癌皮下瘤模型檢測(cè)mPEG-PLGA-PLL納米粒的體內(nèi)靶向性。利用小鼠卵巢癌皮下瘤模型再次驗(yàn)證共載納米粒的療效并同時(shí)檢測(cè)納米粒的體內(nèi)毒性，并對(duì)納米粒的轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行體內(nèi)驗(yàn)證

[36]。圖2 共載紫杉醇及miRNA的mPEG-PLGA-PLL納米粒示意圖Figure 2 Schematic illustration of mPEG-PLGA-PLL nanoparticles co-delivered withpaclitaxel and microRNA所以本研究使用mPEG-PLGA-PLL共同包載紫杉醇和miR-7，采用多種方法對(duì)其進(jìn)行表征以期達(dá)到合適粒徑、形態(tài)、包封率，驗(yàn)證納米粒對(duì)RNA的保護(hù)作用，評(píng)價(jià)藥物釋放，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)（圖2）。
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R737.31

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 吳小華;陳亞楠;楊波;周楠;王娜;許鵬宇;;細(xì)胞自噬與卵巢癌SKOV3細(xì)胞及其耐藥株SKOV3/DDP對(duì)順鉑敏感性的關(guān)系[J];腫瘤;2013年10期

本文編號(hào)：2625044