【摘要】：目的:1.體外分離人子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞(human endometrial mesenchymal stem cell,hEMSCs),探討其是否具有MSCs特性。2.研究堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)與轉(zhuǎn)化生長因子-β_1(Transforming growth factors-β_1,TGF-β_1)對體外培養(yǎng)hEMSCs向韌帶成纖維細(xì)胞分化作用影響。方法:1.hEMSCs的體外分離、鑒定:采用酶消法結(jié)合反復(fù)貼壁法分離純化獲得的hEMSCs。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面特異抗原陽性率。采用特定的誘導(dǎo)培養(yǎng)基體外誘導(dǎo)hEMSCs向成脂細(xì)胞、成骨細(xì)胞及成軟骨細(xì)胞的分化,并分別使油紅0染色、茜素紅染色及阿利新藍(lán)染色法檢測hEMSCs向成脂、成骨及成軟骨細(xì)胞分化效果。MTS檢測細(xì)胞增殖活性并繪制細(xì)胞的生長曲線。2.使用第四代hEMSCs,按照在培養(yǎng)基中分別添加bFGF、TGF-β_1以及bFGF+TGF-β_1聯(lián)合處理為實(shí)驗(yàn)組,加入正常培養(yǎng)基為對照組。培養(yǎng)3天后倒置相差顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化情況;培養(yǎng)12、24、36、48、60h MTS檢測各組細(xì)胞增殖活性情況;培養(yǎng)3天后采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測各組細(xì)胞Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)情況及免疫熒光檢測各組細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)情況。3.應(yīng)用graphpad prism 7軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。所有數(shù)據(jù)結(jié)果均采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(?±)表示。兩組間差異比較采用t檢驗(yàn),以α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn),P0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1.采用酶消法結(jié)合反復(fù)貼壁法可體外分離純化hEMSCs。倒置顯微鏡下觀察hEMSCs經(jīng)多次傳代后其細(xì)胞形態(tài)均一,呈成纖維樣,呈旋渦狀或平行排列生長。流式細(xì)胞儀檢測第四代hEMSCs表面特異抗原表現(xiàn)出CD73、CD90、CD105陽性,分別為99.9%、97.3%、99.7%;CD34、CD45、CD11b、CD19及HLA-DR陰性,為1.7%。油紅O染色顯示:成脂誘導(dǎo)后,細(xì)胞漿內(nèi)可見脂滴;茜素紅染色顯示:成骨誘導(dǎo)后細(xì)胞外存在多個(gè)礦化結(jié)節(jié);阿利新藍(lán)染色顯示:成軟骨誘導(dǎo)后,大量的糖胺聚糖被分泌到細(xì)胞基質(zhì)中。細(xì)胞生長曲線顯示細(xì)胞增殖能力強(qiáng)。以上結(jié)果證實(shí)獲得的細(xì)胞符合間充質(zhì)干細(xì)胞的特征。2.分別經(jīng)bFGF、TGF-β_1及bFGF+TGF-β_1聯(lián)合干預(yù)后:(1)培養(yǎng)3天后倒置相差顯微鏡下觀察示細(xì)胞形態(tài)結(jié)果顯示:與對照組比較,bFGF組、bFGF+TGF-β_1組細(xì)胞形態(tài)更加細(xì)長,呈“樹突”狀,更趨向于成纖維細(xì)胞特性,而TGF-β_1組細(xì)胞形態(tài)增寬,呈擴(kuò)散趨勢。(2)MTS檢測培養(yǎng)12、24、36、48、60h各組細(xì)胞細(xì)胞增殖速率結(jié)果顯示:bFGF組、TGF-β_1組、bFGF+TGF-β_1組細(xì)胞增殖速率較對照組均明顯增快,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與bFGF組、TGF-β_1組相比較,bFGF+TGF-β_1組細(xì)胞增殖速率增快更加明顯,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);提示bFGF與TGF-β_1均可以促進(jìn)細(xì)胞增殖,且兩者聯(lián)合后促進(jìn)細(xì)胞增殖作用更加顯著。(3)培養(yǎng)3天后實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示:與對照組比較,bFGF組Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)明顯下調(diào),TGF-β_1組及bFGF+TGF-β_1組Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)均上調(diào),差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),但bFGF+TGF-β_1組Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)上調(diào)趨勢小,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(4)免疫熒光染色結(jié)果顯示:I型膠原蛋白主要分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。與對照組比較,bFGF組Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)明顯降低,TGF-β_1組及bFGF+TGF-β_1組Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)均有所增加,但bFGF+TGF-β_1組Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)增加程度小。結(jié)論:1.hEMSCs具有MSCs特征,可作為韌帶組織工程種子細(xì)胞來源。2.bFGF可促使hEMSCs細(xì)胞形態(tài)更趨向成纖維細(xì)胞特性。bFGF與TGF-β_1聯(lián)合促進(jìn)hEMSCs增殖的效果更加明顯。bFGF、TGF-β_1對I型膠原合成具有一定的拮抗作用,bFGF具有抑制I型膠原合成的效應(yīng),而TGF-β_1則具有促進(jìn)I型膠原合成的效應(yīng),bFGF與TGF-β_1聯(lián)合使I型膠原的合成和降解的處于動態(tài)平衡的狀態(tài),總體增加了I型膠原的表達(dá)量,對hEMSCs向韌帶成纖維細(xì)胞分化具有促進(jìn)作用。
【圖文】：

山西醫(yī)科大學(xué)（博）碩士學(xué)位論文1 hEMSCs 的原代及傳代培養(yǎng)采用酶消化法獲取的 hEMSCs，在體外能快速貼壁生長，增殖速率快，倒置微鏡觀察到原代 hEMSCs 接種 4-5d 后大部分能貼壁，呈短梭形或紡錘形，見細(xì)胞達(dá)到 80%融合時(shí)將細(xì)胞進(jìn)行消化、傳代。經(jīng) 1-2 次傳代后，獲得的 hEM度較高。傳代培養(yǎng)的細(xì)胞，貼壁時(shí)間快，約 2-4h，形態(tài)較為均一，傳代培養(yǎng) 3-4融合達(dá) 80-90%，細(xì)胞大多為細(xì)長、均一的成纖維樣細(xì)胞，呈旋渦狀或平行排，見圖 1-B。2 結(jié)果

圖 2 流式細(xì)胞儀檢測第四代 hEMSCs 表面特異性抗原的表達(dá)情況A: PE-negative CD34+CD19+CD45+CD11b+HLA-DR； B: APC- CD73； C:FITC-PerCP-Cy5-5- CD105.2 細(xì)胞染色法觀察 hEMSCs 向成脂、成骨及成軟骨細(xì)胞分化.2.1 hEMSCs 成脂誘導(dǎo)結(jié)果誘導(dǎo)培養(yǎng) 3d 后觀察，，細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)由長梭形逐漸縮短變圓或多邊形漿內(nèi)出現(xiàn)脂滴樣物質(zhì)，更換誘導(dǎo)培養(yǎng)基后也不會消失。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的物質(zhì)逐漸變大，誘導(dǎo) 19d 后油紅 O 染色顯示：胞漿內(nèi)脂滴被染成紅色
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R711.5

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本文編號：2588962