【摘要】：背景卵巢癌發(fā)病的病理過(guò)程錯(cuò)綜復(fù)雜,目前發(fā)病機(jī)制尚不清楚。已有許多相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明在卵巢癌中檢測(cè)到不同基因不同程度的甲基化,并認(rèn)為其與卵巢癌的發(fā)生密切相關(guān)。P16作為一種負(fù)向調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的抑癌基因,當(dāng)其啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生甲基化時(shí),抑制該基因轉(zhuǎn)錄表達(dá),造成細(xì)胞惡性增殖。有學(xué)者在卵巢癌中檢測(cè)到P16基因發(fā)生了甲基化,并且認(rèn)為這與卵巢癌的發(fā)生有一定的關(guān)系;而另有學(xué)者則通過(guò)薈萃分析認(rèn)為P16基因的甲基化與卵巢癌的關(guān)系并不顯著相關(guān)。目的本實(shí)驗(yàn)旨在研究P16基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島在上皮性卵巢癌(EOC)組織樣本中的甲基化改變,探究其與EOC發(fā)病的關(guān)系。方法收集住院病人診斷為EOC(III期)的卵巢組織樣本13例(包括8例漿液性囊腺癌,1例黏液性囊腺癌,1例子宮內(nèi)膜樣癌),因子宮疾病行全子宮及雙附件切除術(shù)的正常卵巢組織樣本2例,術(shù)后均由病理科確診;采用甲基化特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(MS-PCR)測(cè)定樣本中P16基因甲基化狀態(tài)及評(píng)估PCR引物擴(kuò)增的最適溫度;運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)技術(shù)再次測(cè)定樣本中甲基化狀態(tài),用克隆測(cè)序?qū)CR特異產(chǎn)物進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果1 MS-PCR方法檢測(cè)P16基因甲基化狀態(tài)1.1 P16基因啟動(dòng)子CpG島甲基化在EOC和正常卵巢組織中發(fā)生率分別為69.2%(9/13)、50.0%(1/2),兩者進(jìn)行比較P0.05,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;EOC中P16基因甲基化在漿液性囊腺癌、黏液性囊腺癌和子宮內(nèi)膜樣癌中發(fā)生率分別為72.7%(8/11)、100%(1/1)、0%(0/1),三種組織學(xué)類(lèi)型之間進(jìn)行比較,P0.05,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;1.2實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組在退火溫度60-56℃時(shí)電泳出特異性PCR產(chǎn)物的條帶,低于54℃時(shí)出現(xiàn)非特異性產(chǎn)物的條帶;2 qPCR方法檢測(cè)P16基因甲基化狀態(tài)P16基因啟動(dòng)子CpG島甲基化在EOC和正常卵巢組織中發(fā)生率分別為0%(0/13)、0%(0/2),兩者進(jìn)行比較P0.05,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)所研究的P16基因啟動(dòng)子CpG島未發(fā)生甲基化,暫不認(rèn)為其與EOC的發(fā)病具有相關(guān)性。
【圖文】：

結(jié)果1 DNA 純度檢測(cè)納入研究組的 13 例樣本及對(duì)照組的 2 例樣本，微量紫外分光光度計(jì)讀取 260nm和 280nm 波長(zhǎng)處的光密度(optical density，OD)值， OD260/OD280 均在 1.7-1.9 之間。2 DNA 亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化查詢(xún) NCBI 的 Genebank，版號(hào) hg38 基因?yàn)?P16 基因組參考序列，具體如下圖 2，圖中 CpG 和 C2T 均為 P16 基因亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后的 DNA 序列，其中 CpG 序列是高度甲基化的，而 C2T 序列是非甲基化的，圖中小寫(xiě) t 為兩者差異位點(diǎn)，標(biāo)綠處為 P16探針識(shí)別位置。

ACTB-R CCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAAACTB-P HEX-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-BR 擴(kuò)增及電泳成的引物進(jìn)行梯度 PCR，電泳圖顯示退火溫度為 60℃-56℃時(shí)，非卵織 bisDNA 顯示有特異的擴(kuò)增條帶，，當(dāng)退火溫度低于 56℃時(shí)，均出現(xiàn)，且條帶亮度強(qiáng)弱區(qū)別不顯著，如圖 3。
【學(xué)位授予單位】：新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R737.31

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本文編號(hào)：2588204