【摘要】：卵巢癌是致死率最高的婦科惡性腫瘤；大多數(shù)病人在確診后5年內死亡。預后差主要是由于多數(shù)病人確診時已是晚期,腫瘤大多已發(fā)生轉移。上皮-間質轉化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)是腫瘤轉移過程中的重要組成部分。通過對卵巢癌的整合性分析,我們發(fā)現(xiàn)了調控EMT過程的主要的microRNA(miRNA)調控網(wǎng)絡,其中包括miR-101。本研究中,我們討論miR-101在EMT調控過程中的作用。通過熒光素酶報告基因分析,我們證明miR-101通過直接抑制ZEB1和ZEB2的3’非編碼區(qū)(3'-untranslated region3'-UTR),從而上調E-cadherin的表達。過表達miR-101可顯著抑制EMT過程及腫瘤細胞的遷移和侵襲。過表達ZEB1或ZEB2基因,miR-101不能增加E-cadherin的表達。上調卵巢癌細胞中miR-101的水平,miR-200家族無明顯變化。我們的研究表明miR-101可通過調控E-cadherin的兩個轉錄抑制因子,從而調控EMT過程,此過程不依賴于miR-200家族。本研究分為四個部分進行： 1.對TCGA數(shù)據(jù)中459例漿液性卵巢癌的DNA拷貝數(shù)變化,啟動子甲基化及miRNA表達數(shù)據(jù)進行整合分析,識別TCGA中間質表型基因表達譜。篩選7個漿液性卵巢癌細胞系,測定7個細胞系miR-101及E-cadherin的表達水平,檢查二者是否存在正相關。 2.將miR-101轉染進卵巢癌細胞系,觀察外源性miR-101對卵巢癌細胞EMT、遷移及侵襲的影響。 3.構建pmirGLO-ZEB1, pmirGLO-ZEB2質粒和pmirGLO-ZEB13'-UTR-Ml, pmirGLO-ZEB13'-UTR-M2以及pmirGLO-ZEB23'-UTR-M突變質粒。檢測miR-101是否直接靶向調控ZEB1和ZEB2。檢測miR-101是否能夠下調ZEB1和ZEB2的水平。 4.分別使用2個針對不同作用位點的siRNA下調卵巢癌細胞中ZEB1或ZEB2蛋白的表達,觀察是否同轉染miR-101后的效果相似。構建ZEB1和ZEB2過表達質粒pcDNA3.1(+)-ZEBl和pcDNA3.1(+)-ZEB2,轉染卵巢癌細胞,篩選穩(wěn)定轉染的細胞系。將miR-101轉染穩(wěn)定克隆細胞,觀察ZEB1和ZEB2的表達是否下調,E-cadherin表達水平是否依然升高,以證實miR-101對EMT的抑制作用是由ZEB1和ZEB2介導的。通過本實驗,可以得出以下幾個結論： 1.對TCGA數(shù)據(jù)中459例漿液性卵巢癌進行整合分析,將其分為上皮亞型(iE)和間質亞型(iM),后者與預后差相關。8個1niRNAs (miR-25, miR-506, miR-29c, miR-182,miR-128,miR-101,miR-141,and miR-200a)可調控89%的miRNA相關基因,且在iM中的表達低于iE。miR-101在iM亞型中低表達和DNA拷貝數(shù)缺失有關。MiR-101在上皮性卵巢癌細胞系中的表達顯著高于間質性細胞系。 2.MiR-101可以顯著增加上皮標志物E-cadherin的水平,下調間質標志物Fibronectin, N-cadherin及Vimentin,改變卵巢癌細胞形態(tài),抑制卵巢癌細胞遷移及侵襲能力。 3.MiR-101通過與ZEB1和ZEB2的3’UTR種子序列特異性結合,直接調控二者的表達,從而抑制卵巢癌EMT過程。 4.MiR-101上調E-cadherin,抑制EMT過程,是通過與ZEB1或ZEB2的3’UTR上miR-101結合位點結合發(fā)揮的作用,該調控不依賴于miR-200家族成員。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R737.31

【參考文獻】

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本文編號：2577528