【摘要】：卵巢癌是女性生殖器官三大惡性腫瘤之一,其發(fā)病率呈逐年上升趨勢,死亡率一直占據(jù)婦科惡性腫瘤首位。卵巢癌以上皮性癌為主,起病隱匿,多數(shù)患者就診時表現(xiàn)為腹水形成及腹腔內(nèi)病灶播散,預(yù)后差。臨床上雖經(jīng)腫瘤細胞減滅術(shù)輔以聯(lián)合化療,但5年生存率仍徘徊在30%左右。卵巢癌高致死率的原因主要因為其廣泛的腹腔轉(zhuǎn)移特性。我們首次發(fā)現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)成熟因子γ在上皮性卵巢癌中高表達,并與卵巢癌患者FIGO分期及化療耐藥相關(guān)。多元回歸模型分析提示神經(jīng)膠質(zhì)成熟因子γ是預(yù)測卵巢癌患者無瘤生存期的獨立因素。但神經(jīng)膠質(zhì)成熟因子γ基因具體的生物學(xué)功能及其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用目前尚知之甚少。 斑馬魚是當今功能基因組時代生命科學(xué)研究中重要的模式動物之一。因此我們借助斑馬魚在研究基因功能方面的優(yōu)勢,探索了神經(jīng)膠質(zhì)成熟因子γ的生物學(xué)功能,嘗試為揭示其在卵巢癌生物學(xué)行為中的作用提供重要依據(jù)。研究應(yīng)用整胚原位雜交和western blot檢測神經(jīng)膠質(zhì)成熟因子p基因和神經(jīng)膠質(zhì)成熟因子γ基因在斑馬魚胚胎發(fā)育中的時空表達模式；基于共聚焦顯微鏡的轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎活體影像技術(shù)用于實時觀察特定部位器官、組織的形態(tài)發(fā)育及細胞水平的運動行為；應(yīng)用基于胚胎顯微注射技術(shù)的morpholino進行基因敲除實驗,體外轉(zhuǎn)錄mRNA進行表型拯救實驗研究神經(jīng)膠質(zhì)成熟因子丫基因在血管芽細胞遷移中的作用；流式細胞術(shù)用于分選轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎血管內(nèi)皮細胞；實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(qRT-PCR)檢測神經(jīng)膠質(zhì)成熟因子基因γ可能下游基因表達水平變化。斑馬魚體內(nèi)研究數(shù)據(jù)提示我們前期發(fā)現(xiàn)的在卵巢癌中高表達的神經(jīng)膠質(zhì)成熟因子γ可能參與了與細胞運動相關(guān)的生物學(xué)行為調(diào)控。因此,我們進一步通過劃痕實驗和transwell小室實驗研究過表達及敲減神經(jīng)膠質(zhì)成熟因子γ后對卵巢癌細胞遷移侵襲能力的影響；熒光標記鬼筆環(huán)肽染色觀察神經(jīng)膠質(zhì)成熟因子γ在卵巢癌細胞肌動蛋白纖維聚合解聚過程中的作用；最后免疫共沉淀用于尋找和驗證可能與神經(jīng)膠質(zhì)成熟因子γ存在相互作用的蛋白分子。結(jié)果表明神經(jīng)膠質(zhì)成熟因子丫通過調(diào)控細胞肌動蛋白細胞骨架重塑增強了癌細胞遷移和侵襲能力,促進了卵巢癌病程進展。本研究為進一步深入研究神經(jīng)膠質(zhì)成熟因子γ在卵巢癌發(fā)生及病程進展中的作用及尋找卵巢癌阻遏新靶點提供了依據(jù)。 第一部分斑馬魚神經(jīng)膠質(zhì)成熟因子丫在斑馬魚血管芽細胞遷移中的作用研究 目的： 克隆斑馬魚神經(jīng)膠質(zhì)成熟因子β基因和神經(jīng)膠質(zhì)成熟因子γ基因,明確它們在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中的表達模式,并闡明神經(jīng)膠質(zhì)成熟因子基因γ在斑馬魚胚胎血管芽細胞遷移過程中的作用。 方法： 整胚原位雜交和western blot用于檢測神經(jīng)膠質(zhì)成熟因子基因β和神經(jīng)膠質(zhì)成熟因子基因γ在斑馬魚胚胎發(fā)育中的時空表達情況。應(yīng)用基于胚胎顯微注射技術(shù)的morpholino進行基因敲除實驗,體外轉(zhuǎn)錄mRNA進行表型拯救實驗。應(yīng)用基于激光共聚焦顯微鏡的轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎活體影像技術(shù)實時觀察特定部位器官、組織的形態(tài)發(fā)育及細胞水平的運動行為。流式細胞術(shù)用于分選轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎血管內(nèi)皮細胞。應(yīng)用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(qRT-PCR)檢測神經(jīng)膠質(zhì)成熟因子基因γ可能下游基因表達水平變化。 結(jié)果： 1.成功克隆了斑馬魚神經(jīng)膠質(zhì)成熟因子基因β和神經(jīng)膠質(zhì)成熟因子γ基因。 2.進化分析顯示神經(jīng)膠質(zhì)成熟因子基因序列在脊椎動物中高度保守。 3.神經(jīng)膠質(zhì)成熟因子β和神經(jīng)膠質(zhì)成熟因子γ在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中的基因表達模式不同。神經(jīng)膠質(zhì)成熟因子β主要表達在頭部。神經(jīng)膠質(zhì)成熟因子γ富集于血管內(nèi)皮細胞,并隨心血管系統(tǒng)發(fā)育而呈現(xiàn)增強表達。 4.在斑馬魚受精卵中敲除神經(jīng)膠質(zhì)成熟因子γ引發(fā)血管芽細胞遷移障礙和血管發(fā)育表型缺陷。這種發(fā)育表型缺陷可以被共注射神經(jīng)膠質(zhì)成熟因子γ mRNA所部分拯救。 5.斑馬魚胚胎內(nèi)皮細胞中神經(jīng)膠質(zhì)成熟因子γ調(diào)控STAT3、VEGFA、MMPs基因的表達。 結(jié)論： 1.神經(jīng)膠質(zhì)成熟因子在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中的表達具有時空特異性。 2.斑馬魚胚胎血管內(nèi)皮細胞的神經(jīng)膠質(zhì)成熟因子丫表達對血管芽細胞遷移運動行為是必需的。 第二部分神經(jīng)膠質(zhì)成熟因子γ在卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用研究 目的： 確定神經(jīng)膠質(zhì)成熟因子γ對卵巢癌細胞運動行為的調(diào)控功能及機制,并闡明其在卵巢癌細胞遷移侵襲中的作用。 方法： 應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測卵巢正常上皮、卵巢腺瘤、卵巢交界性腺瘤及上皮性卵巢癌組織中神經(jīng)膠質(zhì)成熟因子丫的表達情況。western blot用于檢測不同卵巢癌細胞株中神經(jīng)膠質(zhì)成熟因子Y的蛋白水平。通過劃痕實驗和transwell小室實驗研究過表達及敲減神經(jīng)膠質(zhì)成熟因子丫在卵巢癌細胞遷移侵襲中的作用。熒光標記鬼筆環(huán)肽染色觀察神經(jīng)膠質(zhì)成熟因子γ在卵巢癌細胞肌動蛋白纖維聚合解聚過程中的作用；最后免疫共沉淀用于尋找和驗證可能與神經(jīng)膠質(zhì)成熟因子γ存在相互作用的蛋白分子。結(jié)果：1.神經(jīng)膠質(zhì)成熟因子丫在卵巢癌組織中的表達顯著高于正常、腺瘤及交界性腺瘤組織。2.在低表達的卵巢癌細胞株中過表達外源性神經(jīng)膠質(zhì)成熟因子γ增強了卵巢癌細胞遷移侵襲能力。3.在高表達卵巢癌細胞中敲減內(nèi)源性神經(jīng)膠質(zhì)成熟因子γ抑制了卵巢癌細胞遷移侵襲能力。4.卵巢癌細胞株中過表達神經(jīng)膠質(zhì)成熟因子γ后,細胞中密集網(wǎng)絡(luò)樣的肌動蛋白纖維呈現(xiàn)為細長縱行絲狀。5.卵巢癌細胞中神經(jīng)膠質(zhì)成熟因子γ與Arp2/3復(fù)合物存在相互結(jié)合。 結(jié)論： 1.卵巢癌中神經(jīng)膠質(zhì)成熟因子γ高表達與臨床不良預(yù)后相關(guān),可能是潛在的卵巢癌標記物。 2.神經(jīng)膠質(zhì)成熟因子丫可能通過調(diào)控肌動蛋白細胞骨架重塑而增強卵巢癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R737.31

【共引文獻】

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1 衷燦梅;陳豐霖;;12-脂氧合酶與腫瘤相關(guān)的研究進展[J];中華臨床醫(yī)師雜志(電子版);2015年07期

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1 伍品;γδT細胞在人大腸癌炎性微環(huán)境中的作用及機制研究[D];浙江大學(xué);2014年

2 孫強;Mfn2通過調(diào)控TGF-β抑制大鼠腹主動脈慢性排斥反應(yīng)及肝纖維化[D];浙江大學(xué);2014年

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1 朱陽波;血清AFP，，GPC3，DCP和VEGF檢測對肝癌的早期診斷及預(yù)后評估相關(guān)性的研究[D];浙江大學(xué);2014年

本文編號：2568765