【摘要】：目的 探討在上皮性卵巢癌細(xì)胞中果蠅zeste基因增強(qiáng)子同源物2(EZH2)能否調(diào)控乳腺癌第一易感基因(BRCA1)的表達(dá)及其調(diào)控機(jī)制,明確BRCA1在EZH2介導(dǎo)的卵巢癌惡性生物學(xué)進(jìn)展中的作用,從而找到抑制腫瘤進(jìn)展的靶點(diǎn)。 方法 構(gòu)建兩個靶向沉默EZH2基因的短發(fā)夾RNA (shEZH2)質(zhì)粒表達(dá)載體,脂質(zhì)體法穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至上皮性卵巢癌細(xì)胞A2780,瞬時轉(zhuǎn)染至ES2和SKOV3細(xì)胞。實(shí)時熒光定量PCR (qPCR)、免疫印跡和細(xì)胞免疫化學(xué)法檢測下調(diào)EZH2后BRCA1在mRNA和蛋白水平的表達(dá)及細(xì)胞核內(nèi)外分布情況。胰島素樣生長因子1(IGF-1)處理細(xì)胞活化AKT1,細(xì)胞免疫化學(xué)法再次檢測EZH2和BRCA1的表達(dá)及核內(nèi)外分布情況。化學(xué)合成三個靶向沉默BRCA1的小干擾RNA (siRNA),檢驗(yàn)干擾效率后,脂質(zhì)體法瞬時轉(zhuǎn)染至轉(zhuǎn)染了shEZH2和空白對照組細(xì)胞中,MTT、Transwell小室法和流式細(xì)胞儀分別檢測下調(diào)BRCA1表達(dá)對EZH2沉默所引起的卵巢癌增殖、遷移和細(xì)胞周期改變的影響。在順鉑耐藥細(xì)胞中聯(lián)合或單獨(dú)沉默EZH2和BRCA1的表達(dá),MTT法檢測各組細(xì)胞對順鉑敏感性的變化。 結(jié)果 1、上皮性卵巢癌細(xì)胞A2780、ES2和SKOV3中成功抑制EZH2表達(dá)后,BRCA1在mRNA水平上表達(dá)較對照組下調(diào),而在蛋白水平上明顯升高,并且存在由胞漿向胞核轉(zhuǎn)移的趨勢。 2、在轉(zhuǎn)染shEZH2的A2780細(xì)胞中成功激活A(yù)KT1表達(dá)阻斷了BRCA1蛋白的胞漿胞核轉(zhuǎn)移效應(yīng)。 3、沉默EZH2的A2780和ES2細(xì)胞中聯(lián)合敲出BRCA1基因后,細(xì)胞的增殖遷移能力較未聯(lián)合敲出BRCA1基因組增強(qiáng)。 4、卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞A2780/DDP中聯(lián)合沉默EZH2與BRCA1表達(dá)未能疊加單獨(dú)沉默二者產(chǎn)生的細(xì)胞順鉑增敏作用。 結(jié)論 上皮性卵巢癌細(xì)胞中EZH2能調(diào)控BRCA1的表達(dá)及胞漿/胞核轉(zhuǎn)移,該調(diào)控能被活化的AKT1所阻斷。BRCA1下調(diào)能部分逆轉(zhuǎn)EZH2引起的卵巢癌惡性生物學(xué)行為,提示BRCA1在EZH2發(fā)揮原癌基因的作用中起重要作用。 目的 篩選上皮性卵巢癌石蠟標(biāo)本實(shí)時熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)最適內(nèi)參基因。 方法 以real-time PCR和ovarian cancer兩個關(guān)鍵詞在Pubmed查得2010年1月到2013年3月共計128篇全文獲取十二個常用的管家基因(ACTB, GAPDH,18S rRNA, GUSB, PPIA, PBGD, PUM1, TBP, HRPT1, RPLPO, RPL13A和B2M),收集上皮性卵巢組織標(biāo)本(正常、良性、交界性和惡性)共計五十例,運(yùn)用激光顯微切割技術(shù)獲取同質(zhì)性上皮性卵巢組織用于后續(xù)研究。實(shí)時定量PCR所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用單因素方差分析或非參檢驗(yàn)進(jìn)行分析。NormFinder和geNorm兩個軟件進(jìn)一步用于驗(yàn)證候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性和實(shí)用性。 結(jié)果 上皮細(xì)胞在正常卵巢組織中占很小比例。候選內(nèi)參基因中ACTB, PPIA, RPL13A, RPLPO和TBP不受疾病進(jìn)展影響而在正常、良性、交界性和惡性上皮標(biāo)本中相對穩(wěn)定表達(dá),其中NormFinder和geNorm驗(yàn)證得出ACTB, PPIA, RPLPO和TBP的穩(wěn)定組合,而最常用內(nèi)參基因GAPDH在卵巢上皮細(xì)胞中的表達(dá)不穩(wěn)定,在癌組織中的表達(dá)顯著高于其他三類組織。 結(jié)論 在上皮性卵巢腫瘤研究中推薦同質(zhì)性上皮組織的使用和實(shí)時定量PCR實(shí)驗(yàn)多個內(nèi)參基因的聯(lián)合運(yùn)用,例如ACTB, PPIA, RPLPO和TBP。而GAPDH由于其表達(dá)的相對不穩(wěn)定性不宜單獨(dú)用作內(nèi)參校正。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R737.31

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2567894