本文關(guān)鍵詞：TWEAK介導(dǎo)LPS對小鼠uNK細(xì)胞毒性的調(diào)節(jié)作用及分子機(jī)制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：子宮NK細(xì)胞(uNK)是妊娠早期母胎界面數(shù)量最為豐富的淋巴細(xì)胞。uNK細(xì)胞與胎兒的血管形成以及免疫耐受密切相關(guān),在正常妊娠建立與維持中發(fā)揮著重要作用。腫瘤壞死因子樣凋亡微弱誘導(dǎo)劑(TWEAK)通過與其受體纖維母細(xì)胞生長因子誘導(dǎo)分子14(Fn14)相互作用在腫瘤抑制、免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定和各種疾病的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵性的作用。為了研究妊娠早期子宮TWEAK/Fn14介導(dǎo)的天然免疫調(diào)節(jié)及潛在分子機(jī)制,本試驗(yàn)利用LPS誘導(dǎo)建立小鼠流產(chǎn)模型,采用HE染色觀察流產(chǎn)小鼠子宮組織病理學(xué)形態(tài),采用DBA染色方法檢測uNK的動(dòng)態(tài)分布變化,IHC方法確定TWEAK/Fn14的組織表達(dá)分布,IF法分別檢測TWEAK/Fn14、NKG2D、TNFα與uNK細(xì)胞的共定位,Western Blot檢測子宮組織中TWEAK/Fn14蛋白的表達(dá)變化。本研究同時(shí)利用免疫磁珠分選技術(shù)分離純化uNK細(xì)胞后,通過熒光定量PCR及Western Blot方法研究TWEAK/Fn14對uNK細(xì)胞毒性及分泌活性的分子調(diào)節(jié)機(jī)制。研究結(jié)果如下:1.在懷孕后(GD)3天,每只小鼠尾靜脈注射2 ug劑量的LPS,GD 9.5天小鼠發(fā)生流產(chǎn)。HE染色結(jié)果顯示小鼠子宮組織出現(xiàn)充血水腫,炎性細(xì)胞浸潤,組織壞死脫落,以及出血等病理學(xué)變化。采用DBA生物素標(biāo)記檢測發(fā)現(xiàn),正常妊娠小鼠子宮內(nèi)uNK細(xì)胞數(shù)量在妊娠中期(GD 9.5)急劇增加并達(dá)到最高,而LPS處理組uNK細(xì)胞數(shù)量顯著低于正常對照組(P0.05)。利用IHC方法研究子宮TWEAK/Fn14組織分布,發(fā)現(xiàn)TWEAK主要分布于子宮固有層及腺體區(qū),而Fn14主要表達(dá)于腔上皮和腺上皮細(xì)胞。在GD 9.5,LPS處理組小鼠子宮組織出現(xiàn)TWEAK弱染以及Fn14強(qiáng)染。Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)LPS處理組子宮組織TWEAK和Fn14蛋白表達(dá)水平與IHC檢測結(jié)果基本一致。免疫熒光研究發(fā)現(xiàn)uNK細(xì)胞可同時(shí)表達(dá)TWEAK與Fn14,且TWEAK主要分泌于uNK細(xì)胞。同時(shí),我們研究發(fā)現(xiàn)LPS處理組中TNFα+及NKG2D+uNK細(xì)胞所占總uNK細(xì)胞比例較正常受孕組顯著增加(P0.05)。2.為進(jìn)一步研究TWEAK/Fn14通路對LPS作用下uNK細(xì)胞毒性及分泌功能的調(diào)節(jié)機(jī)制,我們采用DBA生物素包被的磁珠分選技術(shù),分離純化了正常妊娠以及LPS處理組小鼠子宮uNK細(xì)胞,Western Blot和RT-PCR結(jié)果顯示TWEAK在uNK細(xì)胞的表達(dá)水平與子宮組織中表達(dá)水平基本一致。相比于正常對照組,NKG2D和TNFα在LPS處理組小鼠uNK細(xì)胞中表達(dá)水平增加。為研究TWEAK對uNK細(xì)胞中NKG2D和TNFα表達(dá)水平的調(diào)節(jié)作用,我們使用重組TWEAK蛋白及TWEAK特異性抗體處理分離的uNK細(xì)胞。Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)添加不同濃度的重組TWEAK蛋白對uNK細(xì)胞中NKG2D及TNFα的表達(dá)水平作用不顯著,而TWEAK特異性抗體作用于uNK細(xì)胞卻導(dǎo)致劑量依賴性上調(diào)NKG2D及TNFα的表達(dá)�；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果及相關(guān)研究報(bào)道,我們選擇JAK2-STAT3信號通路進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)相比于對照組,WP1066抑制劑組,Anti-TWEAK抗體組,WP1066+Anti-TWEAK抗體組及WP1066+TWEAK重組蛋白組中pSTAT3的表達(dá)水平均顯著降低(P0.05)。同時(shí),Western Blot檢測發(fā)現(xiàn),pSTAT3的表達(dá)水平與NKG2D和TNFα的表達(dá)存在負(fù)反饋的調(diào)節(jié)作用。綜上所述,本研究通過建立LPS誘導(dǎo)的流產(chǎn)小鼠和分離純化小鼠uNK細(xì)胞,研究TWEAK介導(dǎo)LPS對uNK細(xì)胞的分泌活性和細(xì)胞毒性的調(diào)節(jié)作用及分子機(jī)制。闡明了LPS誘導(dǎo)流產(chǎn)發(fā)生的TWEAK/Fn14調(diào)節(jié)機(jī)制,即通過調(diào)節(jié)uNK細(xì)胞內(nèi)源性TWEAK表達(dá)分泌水平,負(fù)調(diào)控STAT3的磷酸化水平,進(jìn)而調(diào)控uNK細(xì)胞中活化性受體NKG2D及TNFα的表達(dá)水平,誘導(dǎo)妊娠小鼠流產(chǎn)的發(fā)生。
【關(guān)鍵詞】：小鼠 LPS 流產(chǎn) 子宮NK細(xì)胞 TWEAK Fn14 細(xì)胞毒性功能
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R714
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-11
• 文獻(xiàn)綜述11-16
• 第一章 TWEAK及uNK與妊娠免疫耐受研究進(jìn)展11-16
• 1.1 uNK細(xì)胞與妊娠免疫耐受11-13
• 1.1.1 uNK細(xì)胞命名及特征12
• 1.1.2 uNK細(xì)胞與pNK細(xì)胞12
• 1.1.3 uNK細(xì)胞在妊娠中的作用12-13
• 1.2 TWEAK/Fn14與妊娠免疫耐受研究進(jìn)展13-15
• 1.2.1 TWEAK的發(fā)現(xiàn)、命名及結(jié)構(gòu)13
• 1.2.2 TWEAK的分布及功能13-14
• 1.2.3 Fn14受體概述14-15
• 1.2.4 TWEAK與生殖免疫15
• 1.3 本研究的目的與意義15-16
• 試驗(yàn)研究16-38
• 第二章 LPS誘導(dǎo)的流產(chǎn)小鼠子宮中TWEAK /Fn14及uNK變化規(guī)律研究16-28
• 2.1 材料17-18
• 2.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與取材17
• 2.1.2 主要試劑17-18
• 2.1.3 主要儀器18
• 2.2 方法18-20
• 2.2.1 子宮組織病理學(xué)觀察18
• 2.2.2 DBA染色檢測uNK細(xì)胞18-19
• 2.2.3 IHC檢測子宮中TWEAK和Fn14分布表達(dá)19
• 2.2.4 Western Blot檢測子宮中TWEAK和Fn14蛋白的表達(dá)19-20
• 2.2.5 免疫熒光法檢測20
• 2.3 結(jié)果20-26
• 2.3.1 子宮組織病理學(xué)變化20-21
• 2.3.2 uNK細(xì)胞分布及數(shù)量變化21-22
• 2.3.3 子宮組織中TWEAK及Fn14分布表達(dá)變化22-23
• 2.3.4 子宮組織中TWEAK及Fn14蛋白表達(dá)23-24
• 2.3.5 子宮組織中TWEAK/uNK與Fn14/uNK的表達(dá)分布24-25
• 2.3.6 子宮組織中NKG2D/uNK與TNFα/uNK的表達(dá)分布25-26
• 2.4 討論26-27
• 2.5 小結(jié)27-28
• 第三章 TWEAK/Fn14對uNK細(xì)胞毒性功能調(diào)節(jié)機(jī)制研究28-38
• 3.1 材料28-29
• 3.1.1 主要試劑28-29
• 3.1.2 主要儀器29
• 3.2 方法29-32
• 3.2.1 小鼠uNK細(xì)胞分離29-30
• 3.2.2 uNK細(xì)胞中TWEAK/Fn14的蛋白表達(dá)30
• 3.2.3 uNK細(xì)胞中TWEAK/ Fn14 mRNA變化30-32
• 3.2.4 uNK細(xì)胞中NKG2D與TNFα 表達(dá)32
• 3.2.5 重組蛋白TWEAK作用或其TWEAK特異性抗體封閉后uNK細(xì)胞中NKG2D與TNFα 表達(dá)32
• 3.2.6 JAK2-STAT3信號通路試驗(yàn)32
• 3.3 結(jié)果32-36
• 3.3.1 uNK細(xì)胞分離純化32
• 3.3.2 小鼠uNK細(xì)胞中TWEAK及Fn14表達(dá)變化32-34
• 3.3.3 GD9.5 小鼠uNK細(xì)胞中NKG2D及TNFα 表達(dá)水平34
• 3.3.4 TWEAK及anti-TWEAK對小鼠uNK細(xì)胞毒性的影響34-35
• 3.3.5 JAK2-STAT3信號通路調(diào)節(jié)小鼠uNK細(xì)胞的毒性功能35-36
• 3.4 討論36-37
• 3.5 小結(jié)37-38
• 結(jié)論38-39
• 參考文獻(xiàn)39-46
• 附錄46-47
• 縮略詞表47-48
• 致謝48-49
• 作者簡介49

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本文編號：256432