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不同化療模式對(duì)卵巢癌裸鼠移植瘤中CD133表達(dá)的影響

發(fā)布時(shí)間:2019-11-09 22:15
【摘要】:卵巢上皮性癌(epithelial ovarian cancer,EOC)(以下簡(jiǎn)稱為卵巢癌)是惡性腫瘤的第五大殺手,在婦科惡性腫瘤中死亡率居于首位[1]。標(biāo)準(zhǔn)的治療模式是徹底的腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)合并鉑類為基礎(chǔ)的化療方案,但較高的耐藥性和不可避免的復(fù)發(fā)對(duì)傳統(tǒng)的最大耐受劑量間斷化療的模式,即MTD(maximum tolerated dose)模式發(fā)出挑戰(zhàn)[2]。而我們首先要做的是尋找腫瘤耐藥、復(fù)發(fā)的根源。 近年來,研究發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、化療耐藥和復(fù)發(fā)與腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cell,CSC)密切相關(guān)。在實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)方面,目前CSC的定義:可自我更新或再生的部分惡性細(xì)胞,可成功地異種移植并呈現(xiàn)與原腫瘤相同的具有異質(zhì)性的細(xì)胞表面標(biāo)志物或表型[3]。通常情況下化療能夠殺滅大多數(shù)增殖狀態(tài)的腫瘤細(xì)胞,殘存CSCs能夠充填原來的空缺,形成新的瘤灶[4]。然而CSCs的子細(xì)胞也可遺傳CSCs的耐藥性特征,導(dǎo)致復(fù)發(fā)癌的化療低反應(yīng)。研究證實(shí)CSCs的數(shù)目與腫瘤難治性成正比[5]。一系列動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證明MTD化療模式能富集CSCs[6],為復(fù)發(fā)埋下隱患。因此,我們推測(cè),減少殘存腫瘤中的CSCs,使原有的無分化潛能的腫瘤細(xì)胞處于主要地位,能夠有效地保持化療的敏感性,可能成為抵抗耐藥、降低復(fù)發(fā)率、改善預(yù)后的突破口。 低劑量持續(xù)化療(low-dose metronomic chemotherapy,LDM)作為一種新的化療模式于2000年由Browder等[7]首次提出并得到關(guān)注。胰腺癌、腦膠質(zhì)瘤等異體移植瘤實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)LDM化療后腫瘤中CSCs比率減少[8]。因此,LDM為基礎(chǔ)的化療模式可能對(duì)CSCs針對(duì)性治療更有效,有望為臨床卵巢癌治療提供新思路。 目的: 1CSCs是導(dǎo)致化療后腫瘤耐藥、復(fù)發(fā)的根源。本研究通過對(duì)裸鼠荷人卵巢癌SKOV3模型模擬進(jìn)行順鉑MTD及LDM模式化療,檢測(cè)不同化療模式對(duì)卵巢上皮性癌CSCs樣細(xì)胞的影響,以期為臨床治療提供新思路。 2本研究應(yīng)用CD133單克隆抗體進(jìn)行細(xì)胞分選,并測(cè)定CD133陽性細(xì)胞的干細(xì)胞特性,進(jìn)而探討CD133作為卵巢癌CSCs標(biāo)記物的可行性。 方法: 1建立裸鼠異種移植瘤模型并進(jìn)行不同模式化療,定時(shí)監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)情況及化療副反應(yīng)。 將卵巢上皮性癌SKOV3細(xì)胞1×107個(gè),0.2ml無血清培養(yǎng)基重懸,接種于16-18g雌性裸鼠右側(cè)的大腿皮下,建立皮下異種移植瘤模型。2-3周后,當(dāng)移植瘤體積達(dá)150-200mm3時(shí),將裸鼠隨機(jī)分為三組即MTD組、LDM組、對(duì)照組。MTD組給予順鉑3mg/kg腹腔注射,3天為1周期,共6個(gè)周期;LDM組1mg/kg連續(xù)化療18天;對(duì)照組給予等量生理鹽水。 每天腹腔注射前稱重裸鼠,每3天測(cè)量并記錄移植瘤的體積、食量,每6天抽取尾靜脈血檢測(cè)白細(xì)胞。同時(shí)在實(shí)驗(yàn)過程中,密切觀察化療對(duì)裸鼠的副反應(yīng),包括體重的下降、食量減少、白細(xì)胞減少情況、行為和飲食的變化以及皮膚顏色的改變。 2流式細(xì)胞分選術(shù)分離并獲得CD133陽性細(xì)胞和陰性細(xì)胞。 化療結(jié)束后3-7天,獲得三組腫瘤原代細(xì)胞。采用CD133熒光抗體標(biāo)記后細(xì)胞表現(xiàn)出不同的熒光強(qiáng)度,經(jīng)過流式細(xì)胞分選術(shù)分離獲得兩群細(xì)胞,即:熒光較強(qiáng)的細(xì)胞群(定義為CD133陽性細(xì)胞)和熒光相對(duì)較弱的細(xì)胞群(CD133陰性細(xì)胞)。 3測(cè)定CD133陽性細(xì)胞的部分CSCs樣特性。 3.1體外克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察分選所得CD133陽性及CD133陰性細(xì)胞克隆形成率。 由于流式細(xì)胞分選后所得CD133陽性細(xì)胞數(shù)目較少,且一部分在實(shí)驗(yàn)中受損失去活性,本實(shí)驗(yàn)將三組細(xì)胞所得CD133陽性細(xì)胞混合培養(yǎng),3天后細(xì)胞換液并選取活性好的貼壁細(xì)胞進(jìn)行體外克隆形成實(shí)驗(yàn),CD133陰性細(xì)胞給予相同處理。兩種細(xì)胞同時(shí)接種于6孔板,每種細(xì)胞3個(gè)孔,待出現(xiàn)肉眼可見克隆時(shí)終止實(shí)驗(yàn),重復(fù)試驗(yàn)3次,比較兩種細(xì)胞克隆形成情況,并計(jì)算各自的克隆形成率。 3.2Western blot方法檢測(cè)CD133陽性細(xì)胞與CD133陰性細(xì)胞中乳腺癌耐藥相關(guān)蛋白(BCRP)的表達(dá)。 應(yīng)用Western blot方法檢測(cè)蛋白,細(xì)胞數(shù)目至少達(dá)105,而流式細(xì)胞分選所得CD133陽性細(xì)胞較少,不足以分組進(jìn)行蛋白測(cè)定,因此將3組腫瘤細(xì)胞分選后所得CD133陽性細(xì)胞直接混合后提取蛋白進(jìn)行BCRP和下面所述的Ki-67蛋白的測(cè)定。CD133陰性細(xì)胞同樣混合后實(shí)驗(yàn)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。 3.3Western blot方法檢測(cè)CD133陽性細(xì)胞與CD133陰性細(xì)胞中的Ki-67蛋白的表達(dá)。 4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,方差齊性檢驗(yàn),三組以上采用方差分析,組間差異采用LSD法,兩組數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn),以α0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn),當(dāng)P<0.05時(shí),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;當(dāng)P>0.05時(shí),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果: 1LDM較MTD模式化療更明顯地抑制腫瘤生長(zhǎng),且副反應(yīng)可耐受。 將SKOV3細(xì)胞1×107個(gè)接種于30只雌性裸鼠右側(cè)大腿皮下,成瘤率為100%,2-3周后當(dāng)移植瘤體積150-200mm3時(shí),將裸鼠隨機(jī)分為三組:MTD組、LDM組、對(duì)照組,移植瘤平均體積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);熃Y(jié)束時(shí),統(tǒng)計(jì)三組移植瘤平均體積分別為564.72±43.89mm3、382.25±28.09mm3、782.01±34.24mm3,兩兩之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)公式,抑瘤率=(對(duì)照組移植瘤平均體積-實(shí)驗(yàn)組移植瘤平均體積)/對(duì)照組移植瘤平均體積×100%,計(jì)算抑瘤率:MTD組抑瘤率為27.78%,LDM組抑瘤率為51.12%。表明LDM化療較MTD模式對(duì)于腫瘤生長(zhǎng)的抑制更有效。 化療過程中,MTD組和LDM組與對(duì)照組比較,裸鼠均出現(xiàn)體重減輕(P0.05)、食量減少(P0.05)、白細(xì)胞減少(P0.05)、精神萎靡等副反應(yīng),但根據(jù)化療副反應(yīng)的分級(jí),化療副反應(yīng)屬于Ⅰ級(jí),表明裸鼠能夠一定程度的耐受化療。LDM組較MTD組化療副反應(yīng)未發(fā)現(xiàn)明顯差異,上述指標(biāo)在兩組數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)中均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 2MTD化療能富集腫瘤中的CD133陽性細(xì)胞,而LDM化療則降低其在腫瘤中的表達(dá)。 流式細(xì)胞分選術(shù)檢測(cè)CD133陽性細(xì)胞在LDM組腫瘤中所占比率(0.247%±0.021%),明顯低于對(duì)照組(0.413%±0.021%,P=0.001)。而MTD組CD133陽性細(xì)胞比率為(1.463%±0.208%)較對(duì)照組顯著升高(P=0.000)。結(jié)果表明,傳統(tǒng)的MTD化療能富集CD133陽性細(xì)胞,而LDM模式則顯著降低其表達(dá)。 3CD133陽性細(xì)胞表現(xiàn)出部分CSCs樣特性。 3.1CD133陽性細(xì)胞較CD133陰性細(xì)胞顯示較強(qiáng)的克隆形成能力。 應(yīng)用體外平板克隆實(shí)驗(yàn)比較CD133陽性細(xì)胞和CD133陰性細(xì)胞的克隆形成能力:將兩種細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液,接種至6孔板中,,每種細(xì)胞3孔,每孔接種500個(gè)細(xì)胞,2-3周后出現(xiàn)肉眼可見的細(xì)胞克隆時(shí)終止培養(yǎng),鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)30個(gè)的克隆球。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。 克隆形成率(%)=克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%,統(tǒng)計(jì)CD133陽性細(xì)胞的克隆形成率(49.8%±2.03%)顯著高于CD133陰性細(xì)胞(3.31%±0.61%,P=0.00)。結(jié)果表明,CD133陽性細(xì)胞具有更強(qiáng)的克隆形成能力,這也是CSC鑒定的一個(gè)重要條件。 3.2CD133陽性細(xì)胞較CD133陰性細(xì)胞耐藥性強(qiáng)。 耐藥蛋白BCRP能獨(dú)立或聯(lián)合經(jīng)典耐藥蛋白P-糖蛋白(P-gp)、多重耐藥蛋白(MRP)介導(dǎo)多藥耐受。Western blot結(jié)果顯示,耐藥蛋白BCRP在CD133陽性細(xì)胞中表達(dá)(0.677±0.032)顯著高于CD133陰性細(xì)胞(0.228±0.018,P0.05)。 3.3CD133陽性細(xì)胞增殖活性較CD133陰性細(xì)胞差。 Ki-67是一種增殖細(xì)胞相關(guān)的核抗原,在細(xì)胞增殖中不可或缺,只表達(dá)于增生的細(xì)胞,靜止的細(xì)胞中不表達(dá),通過檢測(cè)Ki-67蛋白了解惡性腫瘤的細(xì)胞增殖活性。 Western blot檢測(cè)Ki-67蛋白在兩種細(xì)胞中的表達(dá)結(jié)果:CD133陽性細(xì)胞(0.215±0.001)vs陰性細(xì)胞(0.739±0.009),P0.05。提示CD133陽性細(xì)胞較陰性細(xì)胞增殖活性差,符合CSCs的休眠的存在狀態(tài)的特性。 結(jié)論:1順鉑LDM模式化療較傳統(tǒng)MTD化療能顯著減緩裸鼠移植瘤的生長(zhǎng), 并能耐受化療副反應(yīng)。 2CD133陽性細(xì)胞表現(xiàn)出部分的CSC樣特性。 3順鉑LDM模式化療可降低卵巢癌移植瘤中CSC樣細(xì)胞的比率,與MTD化療能富集干細(xì)胞相比較,可能更有助于減少耐藥性、降低復(fù)發(fā)率,改善患者預(yù)后。
【學(xué)位授予單位】:河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】:碩士
【學(xué)位授予年份】:2014
【分類號(hào)】:R737.31

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