發(fā)布時間：2019-11-09 22:15

【摘要】：卵巢上皮性癌（epithelial ovarian cancer，EOC）（以下簡稱為卵巢癌）是惡性腫瘤的第五大殺手，在婦科惡性腫瘤中死亡率居于首位[1]。標準的治療模式是徹底的腫瘤細胞減滅術(shù)合并鉑類為基礎(chǔ)的化療方案，但較高的耐藥性和不可避免的復發(fā)對傳統(tǒng)的最大耐受劑量間斷化療的模式，即MTD（maximum tolerated dose）模式發(fā)出挑戰(zhàn)[2]。而我們首先要做的是尋找腫瘤耐藥、復發(fā)的根源。 近年來，研究發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移、化療耐藥和復發(fā)與腫瘤干細胞（cancer stem cell,CSC）密切相關(guān)。在實驗腫瘤學方面，目前CSC的定義：可自我更新或再生的部分惡性細胞，可成功地異種移植并呈現(xiàn)與原腫瘤相同的具有異質(zhì)性的細胞表面標志物或表型[3]。通常情況下化療能夠殺滅大多數(shù)增殖狀態(tài)的腫瘤細胞，殘存CSCs能夠充填原來的空缺，形成新的瘤灶[4]。然而CSCs的子細胞也可遺傳CSCs的耐藥性特征，導致復發(fā)癌的化療低反應。研究證實CSCs的數(shù)目與腫瘤難治性成正比[5]。一系列動物實驗已證明MTD化療模式能富集CSCs[6]，為復發(fā)埋下隱患。因此，我們推測，減少殘存腫瘤中的CSCs，使原有的無分化潛能的腫瘤細胞處于主要地位，能夠有效地保持化療的敏感性，可能成為抵抗耐藥、降低復發(fā)率、改善預后的突破口。 低劑量持續(xù)化療（low-dose metronomic chemotherapy，LDM）作為一種新的化療模式于2000年由Browder等[7]首次提出并得到關(guān)注。胰腺癌、腦膠質(zhì)瘤等異體移植瘤實驗中發(fā)現(xiàn)LDM化療后腫瘤中CSCs比率減少[8]。因此，LDM為基礎(chǔ)的化療模式可能對CSCs針對性治療更有效，有望為臨床卵巢癌治療提供新思路。 目的: 1CSCs是導致化療后腫瘤耐藥、復發(fā)的根源。本研究通過對裸鼠荷人卵巢癌SKOV3模型模擬進行順鉑MTD及LDM模式化療，檢測不同化療模式對卵巢上皮性癌CSCs樣細胞的影響,以期為臨床治療提供新思路。 2本研究應用CD133單克隆抗體進行細胞分選，并測定CD133陽性細胞的干細胞特性，進而探討CD133作為卵巢癌CSCs標記物的可行性。 方法: 1建立裸鼠異種移植瘤模型并進行不同模式化療，定時監(jiān)測腫瘤生長情況及化療副反應。 將卵巢上皮性癌SKOV3細胞1×107個，0.2ml無血清培養(yǎng)基重懸，接種于16-18g雌性裸鼠右側(cè)的大腿皮下，建立皮下異種移植瘤模型。2-3周后，當移植瘤體積達150-200mm3時，將裸鼠隨機分為三組即MTD組、LDM組、對照組。MTD組給予順鉑3mg/kg腹腔注射，3天為1周期，共6個周期；LDM組1mg/kg連續(xù)化療18天；對照組給予等量生理鹽水。 每天腹腔注射前稱重裸鼠，每3天測量并記錄移植瘤的體積、食量,每6天抽取尾靜脈血檢測白細胞。同時在實驗過程中，密切觀察化療對裸鼠的副反應，包括體重的下降、食量減少、白細胞減少情況、行為和飲食的變化以及皮膚顏色的改變。 2流式細胞分選術(shù)分離并獲得CD133陽性細胞和陰性細胞。 化療結(jié)束后3-7天，獲得三組腫瘤原代細胞。采用CD133熒光抗體標記后細胞表現(xiàn)出不同的熒光強度，經(jīng)過流式細胞分選術(shù)分離獲得兩群細胞，即：熒光較強的細胞群（定義為CD133陽性細胞）和熒光相對較弱的細胞群（CD133陰性細胞）。 3測定CD133陽性細胞的部分CSCs樣特性。 3.1體外克隆形成實驗觀察分選所得CD133陽性及CD133陰性細胞克隆形成率。 由于流式細胞分選后所得CD133陽性細胞數(shù)目較少，且一部分在實驗中受損失去活性，本實驗將三組細胞所得CD133陽性細胞混合培養(yǎng)，3天后細胞換液并選取活性好的貼壁細胞進行體外克隆形成實驗，CD133陰性細胞給予相同處理。兩種細胞同時接種于6孔板，每種細胞3個孔，待出現(xiàn)肉眼可見克隆時終止實驗，重復試驗3次，比較兩種細胞克隆形成情況，并計算各自的克隆形成率。 3.2Western blot方法檢測CD133陽性細胞與CD133陰性細胞中乳腺癌耐藥相關(guān)蛋白（BCRP）的表達。 應用Western blot方法檢測蛋白，細胞數(shù)目至少達105，而流式細胞分選所得CD133陽性細胞較少，不足以分組進行蛋白測定，因此將3組腫瘤細胞分選后所得CD133陽性細胞直接混合后提取蛋白進行BCRP和下面所述的Ki-67蛋白的測定。CD133陰性細胞同樣混合后實驗。每組實驗重復3次。 3.3Western blot方法檢測CD133陽性細胞與CD133陰性細胞中的Ki-67蛋白的表達。 4統(tǒng)計學方法：采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，計量資料以均數(shù)±標準差表示，方差齊性檢驗，三組以上采用方差分析，組間差異采用LSD法，兩組數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，以α0.05為檢驗水準，當P＜0.05時，差異有統(tǒng)計學意義；當P＞0.05時，差異無統(tǒng)計學意義。 結(jié)果: 1LDM較MTD模式化療更明顯地抑制腫瘤生長,且副反應可耐受。 將SKOV3細胞1×107個接種于30只雌性裸鼠右側(cè)大腿皮下，成瘤率為100%，2-3周后當移植瘤體積150-200mm3時，將裸鼠隨機分為三組：MTD組、LDM組、對照組，移植瘤平均體積差異無統(tǒng)計學意義（P0.05）�；熃Y(jié)束時，統(tǒng)計三組移植瘤平均體積分別為564.72±43.89mm3、382.25±28.09mm3、782.01±34.24mm3，兩兩之間差異均有統(tǒng)計學意義。根據(jù)公式，抑瘤率=（對照組移植瘤平均體積-實驗組移植瘤平均體積）/對照組移植瘤平均體積×100%，計算抑瘤率：MTD組抑瘤率為27.78%，LDM組抑瘤率為51.12%。表明LDM化療較MTD模式對于腫瘤生長的抑制更有效。 化療過程中，MTD組和LDM組與對照組比較，裸鼠均出現(xiàn)體重減輕（P0.05）、食量減少（P0.05）、白細胞減少（P0.05）、精神萎靡等副反應，但根據(jù)化療副反應的分級，化療副反應屬于Ⅰ級，表明裸鼠能夠一定程度的耐受化療。LDM組較MTD組化療副反應未發(fā)現(xiàn)明顯差異，上述指標在兩組數(shù)據(jù)統(tǒng)計中均無統(tǒng)計學意義（P0.05）。 2MTD化療能富集腫瘤中的CD133陽性細胞，而LDM化療則降低其在腫瘤中的表達。 流式細胞分選術(shù)檢測CD133陽性細胞在LDM組腫瘤中所占比率（0.247%±0.021%），明顯低于對照組（0.413%±0.021%，P=0.001）。而MTD組CD133陽性細胞比率為（1.463%±0.208%）較對照組顯著升高（P=0.000）。結(jié)果表明，傳統(tǒng)的MTD化療能富集CD133陽性細胞，而LDM模式則顯著降低其表達。 3CD133陽性細胞表現(xiàn)出部分CSCs樣特性。 3.1CD133陽性細胞較CD133陰性細胞顯示較強的克隆形成能力。 應用體外平板克隆實驗比較CD133陽性細胞和CD133陰性細胞的克隆形成能力：將兩種細胞制備單細胞懸液，接種至6孔板中，，每種細胞3孔，每孔接種500個細胞，2-3周后出現(xiàn)肉眼可見的細胞克隆時終止培養(yǎng)，鏡下計數(shù)細胞數(shù)30個的克隆球。重復實驗3次。 克隆形成率(%)=克隆數(shù)/接種細胞數(shù)×100%，統(tǒng)計CD133陽性細胞的克隆形成率(49.8%±2.03%)顯著高于CD133陰性細胞（3.31%±0.61%，P=0.00）。結(jié)果表明，CD133陽性細胞具有更強的克隆形成能力，這也是CSC鑒定的一個重要條件。 3.2CD133陽性細胞較CD133陰性細胞耐藥性強。 耐藥蛋白BCRP能獨立或聯(lián)合經(jīng)典耐藥蛋白P-糖蛋白（P-gp）、多重耐藥蛋白（MRP）介導多藥耐受。Western blot結(jié)果顯示，耐藥蛋白BCRP在CD133陽性細胞中表達（0.677±0.032）顯著高于CD133陰性細胞(0.228±0.018，P0.05)。 3.3CD133陽性細胞增殖活性較CD133陰性細胞差。 Ki-67是一種增殖細胞相關(guān)的核抗原，在細胞增殖中不可或缺，只表達于增生的細胞，靜止的細胞中不表達，通過檢測Ki-67蛋白了解惡性腫瘤的細胞增殖活性。 Western blot檢測Ki-67蛋白在兩種細胞中的表達結(jié)果：CD133陽性細胞（0.215±0.001）vs陰性細胞（0.739±0.009），P0.05。提示CD133陽性細胞較陰性細胞增殖活性差，符合CSCs的休眠的存在狀態(tài)的特性。 結(jié)論：1順鉑LDM模式化療較傳統(tǒng)MTD化療能顯著減緩裸鼠移植瘤的生長， 并能耐受化療副反應。 2CD133陽性細胞表現(xiàn)出部分的CSC樣特性。 3順鉑LDM模式化療可降低卵巢癌移植瘤中CSC樣細胞的比率，與MTD化療能富集干細胞相比較，可能更有助于減少耐藥性、降低復發(fā)率，改善患者預后。
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R737.31

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本文編號：2558694