【摘要】：卵巢上皮性癌（epithelial ovarian cancer，EOC）（以下簡(jiǎn)稱為卵巢癌）是惡性腫瘤的第五大殺手，在婦科惡性腫瘤中死亡率居于首位[1]。標(biāo)準(zhǔn)的治療模式是徹底的腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)合并鉑類為基礎(chǔ)的化療方案，但較高的耐藥性和不可避免的復(fù)發(fā)對(duì)傳統(tǒng)的最大耐受劑量間斷化療的模式，即MTD（maximum tolerated dose）模式發(fā)出挑戰(zhàn)[2]。而我們首先要做的是尋找腫瘤耐藥、復(fù)發(fā)的根源。 近年來，研究發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、化療耐藥和復(fù)發(fā)與腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cell,CSC）密切相關(guān)。在實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)方面，目前CSC的定義：可自我更新或再生的部分惡性細(xì)胞，可成功地異種移植并呈現(xiàn)與原腫瘤相同的具有異質(zhì)性的細(xì)胞表面標(biāo)志物或表型[3]。通常情況下化療能夠殺滅大多數(shù)增殖狀態(tài)的腫瘤細(xì)胞，殘存CSCs能夠充填原來的空缺，形成新的瘤灶[4]。然而CSCs的子細(xì)胞也可遺傳CSCs的耐藥性特征，導(dǎo)致復(fù)發(fā)癌的化療低反應(yīng)。研究證實(shí)CSCs的數(shù)目與腫瘤難治性成正比[5]。一系列動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證明MTD化療模式能富集CSCs[6]，為復(fù)發(fā)埋下隱患。因此，我們推測(cè)，減少殘存腫瘤中的CSCs，使原有的無分化潛能的腫瘤細(xì)胞處于主要地位，能夠有效地保持化療的敏感性，可能成為抵抗耐藥、降低復(fù)發(fā)率、改善預(yù)后的突破口。 低劑量持續(xù)化療（low-dose metronomic chemotherapy，LDM）作為一種新的化療模式于2000年由Browder等[7]首次提出并得到關(guān)注。胰腺癌、腦膠質(zhì)瘤等異體移植瘤實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)LDM化療后腫瘤中CSCs比率減少[8]。因此，LDM為基礎(chǔ)的化療模式可能對(duì)CSCs針對(duì)性治療更有效，有望為臨床卵巢癌治療提供新思路。 目的: 1CSCs是導(dǎo)致化療后腫瘤耐藥、復(fù)發(fā)的根源。本研究通過對(duì)裸鼠荷人卵巢癌SKOV3模型模擬進(jìn)行順鉑MTD及LDM模式化療，檢測(cè)不同化療模式對(duì)卵巢上皮性癌CSCs樣細(xì)胞的影響,以期為臨床治療提供新思路。 2本研究應(yīng)用CD133單克隆抗體進(jìn)行細(xì)胞分選，并測(cè)定CD133陽性細(xì)胞的干細(xì)胞特性，進(jìn)而探討CD133作為卵巢癌CSCs標(biāo)記物的可行性。 方法: 1建立裸鼠異種移植瘤模型并進(jìn)行不同模式化療，定時(shí)監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)情況及化療副反應(yīng)。 將卵巢上皮性癌SKOV3細(xì)胞1×107個(gè)，0.2ml無血清培養(yǎng)基重懸，接種于16-18g雌性裸鼠右側(cè)的大腿皮下，建立皮下異種移植瘤模型。2-3周后，當(dāng)移植瘤體積達(dá)150-200mm3時(shí)，將裸鼠隨機(jī)分為三組即MTD組、LDM組、對(duì)照組。MTD組給予順鉑3mg/kg腹腔注射，3天為1周期，共6個(gè)周期；LDM組1mg/kg連續(xù)化療18天；對(duì)照組給予等量生理鹽水。 每天腹腔注射前稱重裸鼠，每3天測(cè)量并記錄移植瘤的體積、食量,每6天抽取尾靜脈血檢測(cè)白細(xì)胞。同時(shí)在實(shí)驗(yàn)過程中，密切觀察化療對(duì)裸鼠的副反應(yīng)，包括體重的下降、食量減少、白細(xì)胞減少情況、行為和飲食的變化以及皮膚顏色的改變。 2流式細(xì)胞分選術(shù)分離并獲得CD133陽性細(xì)胞和陰性細(xì)胞。 化療結(jié)束后3-7天，獲得三組腫瘤原代細(xì)胞。采用CD133熒光抗體標(biāo)記后細(xì)胞表現(xiàn)出不同的熒光強(qiáng)度，經(jīng)過流式細(xì)胞分選術(shù)分離獲得兩群細(xì)胞，即：熒光較強(qiáng)的細(xì)胞群（定義為CD133陽性細(xì)胞）和熒光相對(duì)較弱的細(xì)胞群（CD133陰性細(xì)胞）。 3測(cè)定CD133陽性細(xì)胞的部分CSCs樣特性。 3.1體外克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察分選所得CD133陽性及CD133陰性細(xì)胞克隆形成率。 由于流式細(xì)胞分選后所得CD133陽性細(xì)胞數(shù)目較少，且一部分在實(shí)驗(yàn)中受損失去活性，本實(shí)驗(yàn)將三組細(xì)胞所得CD133陽性細(xì)胞混合培養(yǎng)，3天后細(xì)胞換液并選取活性好的貼壁細(xì)胞進(jìn)行體外克隆形成實(shí)驗(yàn)，CD133陰性細(xì)胞給予相同處理。兩種細(xì)胞同時(shí)接種于6孔板，每種細(xì)胞3個(gè)孔，待出現(xiàn)肉眼可見克隆時(shí)終止實(shí)驗(yàn)，重復(fù)試驗(yàn)3次，比較兩種細(xì)胞克隆形成情況，并計(jì)算各自的克隆形成率。 3.2Western blot方法檢測(cè)CD133陽性細(xì)胞與CD133陰性細(xì)胞中乳腺癌耐藥相關(guān)蛋白（BCRP）的表達(dá)。 應(yīng)用Western blot方法檢測(cè)蛋白，細(xì)胞數(shù)目至少達(dá)105，而流式細(xì)胞分選所得CD133陽性細(xì)胞較少，不足以分組進(jìn)行蛋白測(cè)定，因此將3組腫瘤細(xì)胞分選后所得CD133陽性細(xì)胞直接混合后提取蛋白進(jìn)行BCRP和下面所述的Ki-67蛋白的測(cè)定。CD133陰性細(xì)胞同樣混合后實(shí)驗(yàn)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。 3.3Western blot方法檢測(cè)CD133陽性細(xì)胞與CD133陰性細(xì)胞中的Ki-67蛋白的表達(dá)。 4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，方差齊性檢驗(yàn)，三組以上采用方差分析，組間差異采用LSD法，兩組數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，以α0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，當(dāng)P＜0.05時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；當(dāng)P＞0.05時(shí)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果: 1LDM較MTD模式化療更明顯地抑制腫瘤生長(zhǎng),且副反應(yīng)可耐受。 將SKOV3細(xì)胞1×107個(gè)接種于30只雌性裸鼠右側(cè)大腿皮下，成瘤率為100%，2-3周后當(dāng)移植瘤體積150-200mm3時(shí)，將裸鼠隨機(jī)分為三組：MTD組、LDM組、對(duì)照組，移植瘤平均體積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）�；熃Y(jié)束時(shí)，統(tǒng)計(jì)三組移植瘤平均體積分別為564.72±43.89mm3、382.25±28.09mm3、782.01±34.24mm3，兩兩之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)公式，抑瘤率=（對(duì)照組移植瘤平均體積-實(shí)驗(yàn)組移植瘤平均體積）/對(duì)照組移植瘤平均體積×100%，計(jì)算抑瘤率：MTD組抑瘤率為27.78%，LDM組抑瘤率為51.12%。表明LDM化療較MTD模式對(duì)于腫瘤生長(zhǎng)的抑制更有效。 化療過程中，MTD組和LDM組與對(duì)照組比較，裸鼠均出現(xiàn)體重減輕（P0.05）、食量減少（P0.05）、白細(xì)胞減少（P0.05）、精神萎靡等副反應(yīng)，但根據(jù)化療副反應(yīng)的分級(jí)，化療副反應(yīng)屬于Ⅰ級(jí)，表明裸鼠能夠一定程度的耐受化療。LDM組較MTD組化療副反應(yīng)未發(fā)現(xiàn)明顯差異，上述指標(biāo)在兩組數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)中均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 2MTD化療能富集腫瘤中的CD133陽性細(xì)胞，而LDM化療則降低其在腫瘤中的表達(dá)。 流式細(xì)胞分選術(shù)檢測(cè)CD133陽性細(xì)胞在LDM組腫瘤中所占比率（0.247%±0.021%），明顯低于對(duì)照組（0.413%±0.021%，P=0.001）。而MTD組CD133陽性細(xì)胞比率為（1.463%±0.208%）較對(duì)照組顯著升高（P=0.000）。結(jié)果表明，傳統(tǒng)的MTD化療能富集CD133陽性細(xì)胞，而LDM模式則顯著降低其表達(dá)。 3CD133陽性細(xì)胞表現(xiàn)出部分CSCs樣特性。 3.1CD133陽性細(xì)胞較CD133陰性細(xì)胞顯示較強(qiáng)的克隆形成能力。 應(yīng)用體外平板克隆實(shí)驗(yàn)比較CD133陽性細(xì)胞和CD133陰性細(xì)胞的克隆形成能力：將兩種細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，接種至6孔板中，，每種細(xì)胞3孔，每孔接種500個(gè)細(xì)胞，2-3周后出現(xiàn)肉眼可見的細(xì)胞克隆時(shí)終止培養(yǎng)，鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)30個(gè)的克隆球。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。 克隆形成率(%)=克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%，統(tǒng)計(jì)CD133陽性細(xì)胞的克隆形成率(49.8%±2.03%)顯著高于CD133陰性細(xì)胞（3.31%±0.61%，P=0.00）。結(jié)果表明，CD133陽性細(xì)胞具有更強(qiáng)的克隆形成能力，這也是CSC鑒定的一個(gè)重要條件。 3.2CD133陽性細(xì)胞較CD133陰性細(xì)胞耐藥性強(qiáng)。 耐藥蛋白BCRP能獨(dú)立或聯(lián)合經(jīng)典耐藥蛋白P-糖蛋白（P-gp）、多重耐藥蛋白（MRP）介導(dǎo)多藥耐受。Western blot結(jié)果顯示，耐藥蛋白BCRP在CD133陽性細(xì)胞中表達(dá)（0.677±0.032）顯著高于CD133陰性細(xì)胞(0.228±0.018，P0.05)。 3.3CD133陽性細(xì)胞增殖活性較CD133陰性細(xì)胞差。 Ki-67是一種增殖細(xì)胞相關(guān)的核抗原，在細(xì)胞增殖中不可或缺，只表達(dá)于增生的細(xì)胞，靜止的細(xì)胞中不表達(dá)，通過檢測(cè)Ki-67蛋白了解惡性腫瘤的細(xì)胞增殖活性。 Western blot檢測(cè)Ki-67蛋白在兩種細(xì)胞中的表達(dá)結(jié)果：CD133陽性細(xì)胞（0.215±0.001）vs陰性細(xì)胞（0.739±0.009），P0.05。提示CD133陽性細(xì)胞較陰性細(xì)胞增殖活性差，符合CSCs的休眠的存在狀態(tài)的特性。 結(jié)論：1順鉑LDM模式化療較傳統(tǒng)MTD化療能顯著減緩裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)， 并能耐受化療副反應(yīng)。 2CD133陽性細(xì)胞表現(xiàn)出部分的CSC樣特性。 3順鉑LDM模式化療可降低卵巢癌移植瘤中CSC樣細(xì)胞的比率，與MTD化療能富集干細(xì)胞相比較，可能更有助于減少耐藥性、降低復(fù)發(fā)率，改善患者預(yù)后。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R737.31

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 金曉琴;形態(tài)罕見的卵巢腫瘤1例[J];現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志;2000年07期

2 覃英姿;卵巢腫瘤并發(fā)闌尾炎1例報(bào)告[J];中國(guó)校醫(yī);2000年02期

3 韓衛(wèi)紅,李青,李霞;經(jīng)陰道超聲在卵巢腫瘤診斷中的應(yīng)用[J];青島醫(yī)藥衛(wèi)生;2000年03期

4 ;卵巢腫瘤[J];國(guó)外科技資料目錄.醫(yī)藥衛(wèi)生;2000年10期

5 秦平,陳焰;二維超聲及彩色多普勒聯(lián)合應(yīng)用對(duì)卵巢腫瘤的診斷[J];中國(guó)超聲醫(yī)學(xué)雜志;2001年07期

6 王月香;超聲多普勒技術(shù)在卵巢腫瘤診斷上的新進(jìn)展[J];河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2001年06期

7 崔淑莉,徐愛哲,趙世強(qiáng);經(jīng)陰式彩色多普勒對(duì)卵巢腫瘤性質(zhì)判定的臨床意義[J];哈爾濱醫(yī)藥;2001年01期

8 史海英,姜?jiǎng)俳?卵巢腫瘤誤診13例分析[J];腫瘤防治雜志;2001年03期

9 趙信喜;微波快速石蠟切片診斷卵巢腫瘤206例分析[J];中國(guó)誤診學(xué)雜志;2001年05期

10 ;卵巢腫瘤[J];國(guó)外科技資料目錄.醫(yī)藥衛(wèi)生;2001年03期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 李利;王超英;林忠乙;;老年卵巢腫瘤82例分析[A];中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)婦科腫瘤專業(yè)委員會(huì)第六次全國(guó)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2001年

2 楊幼易;;老年婦女卵巢腫瘤手術(shù)治療140例臨床分析[A];中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)婦科腫瘤專業(yè)委員會(huì)第六次全國(guó)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2001年

3 楊帆;楊太珠;羅紅;朱琦;郭文琪;田雨;陳嬌;;生育前期女性卵巢腫瘤39例超聲診斷[A];2005年全國(guó)醫(yī)學(xué)影像技術(shù)學(xué)術(shù)會(huì)議西部論壇論文匯編[C];2005年

4 張海;李光展;吳瑛;盧俊;王慧芳;鄧偉蓮;;經(jīng)陰道彩色多普勒血流圖檢測(cè)卵巢腫瘤血管的臨床價(jià)值[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第六次全國(guó)超聲醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2001年

5 洪樹勛;許紅;曹良杰;;801例卵巢腫瘤臨床分析[A];紀(jì)念卓越的人民醫(yī)學(xué)家林巧稚大夫誕辰100周年——全國(guó)婦產(chǎn)科高級(jí)學(xué)術(shù)論壇論文集[C];2001年

6 梁元姣;葉小勤;;老年婦女雙側(cè)卵巢巨大腫瘤1例報(bào)告[A];中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)婦科腫瘤專業(yè)委員會(huì)第六次全國(guó)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2001年

7 劉力;李冰琳;張啟培;;836例卵巢腫瘤臨床病理分析[A];第八次全國(guó)婦產(chǎn)科學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2004年

8 陳曉玲;紀(jì)莉;吳曉燕;魚紅菊;王琳;;彩色多普勒超聲在卵巢腫瘤診斷中的應(yīng)用[A];第一屆全國(guó)婦產(chǎn)科超聲學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2006年

9 許幼峰;郭e

本文編號(hào)：2558694