【摘要】：表觀遺傳學(xué)是指在基因的DNA序列沒有發(fā)生改變的情況下,基因功能發(fā)生了可遺傳的變化,是以DNA甲基化譜、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)狀態(tài)和基因表達譜描述遺傳現(xiàn)象的一門科學(xué),即研究從基因演繹為表型的過程和機制的一門新興的遺傳學(xué)分支。主要包括DNA甲基化、基因組印記、組蛋白修飾和X染色質(zhì)失活。DNA甲基化是哺乳動物遺傳和遺傳外修飾的重要調(diào)控方式之一,固有DNA甲基化水平和模式的變化會導(dǎo)致生物的表型異常甚至死亡,5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5-mC)的水平和模式是由DNA甲基化和去甲基化共同決定的,胞嘧啶的甲基化修飾是一個動態(tài)可逆過程。5-mC存在去甲基過程,DNA中的5-mC可被進一步修飾形式為5-羥甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine, 5-hmC),5-hmC是在1950s被發(fā)現(xiàn)和報道的,但對這種堿基的分布和重要性一直缺乏詳細(xì)理解。5-mC可被TET(ten-eleven translocation)蛋白家族進一步轉(zhuǎn)化為5-hmC,該過程是DNA去甲基化的1個必要階段。5-hmC的發(fā)現(xiàn)和TET蛋白的研究為DNA甲基化/去甲基化及其生物學(xué)功能提供了新的視點。在原生殖細(xì)胞和胚胎發(fā)育的整個過程中,會發(fā)生全基因組范圍內(nèi)的DNA甲基化模式重排,而這種改變引起的染色體狀態(tài)等一系列變化會決定細(xì)胞的分化方向。在受精卵中觀察到5-hmC的升高伴隨著5-mC的降低,提示5-mC可能被轉(zhuǎn)化為5-hmC。TET蛋白及5-hmC參與了受精過程中父本基因組的重編程過程,小鼠受精卵的父本基因組中存在著5-mC的全面消除的現(xiàn)象,與此同時,5-hmC含量卻顯著增加的現(xiàn)象；相對應(yīng)的母本基因組中卻含有大量5-mC,而5-hmC含量極少。重要的是父本和母本的5-mC/5-hmC這種獨特分布在有絲分裂單細(xì)胞期雙細(xì)胞期以及后來卵裂階段胚胎期都持續(xù)存在。這種特征與小鼠TET3的蛋白表達變化相一致,因此TET3介導(dǎo)的5-mC羥基化修飾可能在哺乳動物早期生命周期中發(fā)揮著重要作用。TET酶和5-hmC在胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells,ESC)和小鼠早期胚胎發(fā)育的研究,表明它們在胚胎干細(xì)胞自我更新和維持,以及內(nèi)細(xì)胞團(Innercell mass,ICM)細(xì)胞的特異性分化中發(fā)揮重要作用。通常TET1和TET2在小鼠胚胎干細(xì)胞內(nèi)表達比TET3豐富,這是由于TET1和TET2表達受到了多能性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及胚胎干細(xì)胞分化潛能的調(diào)控。最近的一篇報道,在豬的早孕胚胎中,TET3在2細(xì)胞期高表達,而TET1,TET2則富集在囊泡階段。然而,關(guān)于TET是否也存在人類早孕絨毛組織中,會發(fā)揮什么樣的作用?三種TET酶與早期自然流產(chǎn)有什么相關(guān)性?這是一個富于挑戰(zhàn)性的研究領(lǐng)域。已有研究證明在人類胎盤中特異位點的DNA甲基化能夠影響胎盤中DNA結(jié)合蛋白的結(jié)合能力,這對于理解DNA甲基化模式在DNA結(jié)合元件募集及隨后的轉(zhuǎn)錄中的作用有重要意義。同時,甲基化可能作用于早孕絨毛組織,即甲基化的異�？赡芤l(fā)胚胎停止發(fā)育、導(dǎo)致自然流產(chǎn),因有學(xué)者研究得出：與正常早孕相比,在早孕流產(chǎn)患者的絨毛中DNMT1表達量顯著減少同時DNA甲基化水平明顯下降,提示甲基化的異�？赡芤l(fā)胚胎停止發(fā)育、導(dǎo)致自然流產(chǎn)。我們的前期研究表明,PEG1、H19、LIT1基因甲基化程度的改變可能與自然流產(chǎn)的發(fā)生相關(guān),即甲基化異常導(dǎo)致的多個基因表達異�？赡苁侨祟愔睬芭咛ベ|(zhì)量不佳、著床前后胚胎停止發(fā)育的重要原因之一,但去甲基化在早期胚胎發(fā)育的過程中所發(fā)揮的作用仍然未知,許多問題亟待解決。流產(chǎn)發(fā)生是一個復(fù)雜的過程,在近40周的妊娠期內(nèi),內(nèi)、外因素交互作用共同影響著母體與胎兒,至今仍有部分原因不明。早期自然流產(chǎn)(early pregnancy loss, EPL)約占全部臨床妊娠(6周后超聲識別)的10-15%。哺乳動物的正常發(fā)育取決于表觀遺傳學(xué)調(diào)控機制準(zhǔn)確無誤地運行。 其中尤為重要的是發(fā)生在原生殖細(xì)胞和胚胎中的基因組范圍內(nèi)的DNA甲基化模式重排等表觀遺傳學(xué)修飾。這些過程的異�？赡苡绊懥嘶虻谋磉_,參與了著床后胚胎停止發(fā)育(即自然流產(chǎn))的發(fā)病機制。DNA的甲基化與去甲基化對維持胚胎的正常發(fā)育和正常妊娠至關(guān)重要,5-mC、5-hmC的動態(tài)變化、TET蛋白的表達參與決定著床前后早期胚胎的命運。本項目擬探索TET酶及5-mC,5-hmC在人類早孕期絨毛組織中的表達量及表達趨勢,進而,我們將對不明原因流產(chǎn)的絨毛組織進行研究,與正常絨毛組織對比分析,總結(jié)去甲基化,或是相關(guān)酶及產(chǎn)物在胚胎發(fā)育過程中可能起到的作用,及與人類自然流產(chǎn)的相關(guān)性。第一部分TET酶及5-mC,5-hmC在人類早孕期絨毛組織中的表達趨勢[研究目的]多項研究已闡明TET蛋白及催化生成的5-hmC參與了胚胎干細(xì)胞的維持和分化過程,去甲基化可能存在于原生殖細(xì)胞和胚胎早期發(fā)育的各個階段。最近的一篇報道,在豬的早孕胚胎中,TET3在2細(xì)胞期高表達,而TETl,TET2則富集在囊泡階段。TET1,TET2,TET3三種蛋白都有不同組織及細(xì)胞內(nèi)將5-mC轉(zhuǎn)變成5-hmC的功能。TET蛋白和5-hmC的研究為DNA甲基化/去甲基化及其生物學(xué)功能提供了新的視點,關(guān)于它們的表達及功能在人類絨毛組織中的研究有限�；钴S的DNA甲基化及去甲基化在即將發(fā)育成胚胎與即將發(fā)育成胚外譜系的細(xì)胞間發(fā)揮著重要的作用,無論是胚胎種植前還是種植后。絨毛組織的生物學(xué)功能類似于胚胎干細(xì)胞,那么TET酶及5-mC,5-hmC在人類早孕期絨毛組織中的表達量及表達趨勢是怎樣的呢?我們對此做一研究。[研究方法]1.本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn),標(biāo)本收集經(jīng)患者知情同意。2012年9月至2013年5月于廣州醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科門診收集：自愿選擇終止妊娠婦女的正常絨毛31例。絨毛樣本均為孕6-8+6周,母齡18-42歲。根據(jù)絨毛組織的不同發(fā)育時期分為3個研究組：①6周(n=10),②7周(11=10),③8周(n=11)。2.人流手術(shù)后,即用生理鹽水漂洗2-3次以去除絨毛組織上帶有的血跡,采用50m1無菌離心管收集絨毛組織,內(nèi)置1xPBS溶液,顯微鏡下挑選、剪取絨毛組織,分裝入1.5m1 EP管內(nèi),凍存-80°。首先進行TET mRNA的檢測：應(yīng)用BiooPure RNA Isolation Reagent (Bioo, USA)提取絨毛組織RNA,RNA的純度和濃度鑒定后行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(Fermentas K1622嚴(yán)格按照試劑操作說明)。RNA水平實驗得出初步結(jié)論后,Western-bloting方法用于TET蛋白表達的驗證： 絨毛組織組織總蛋白的提取,蛋白質(zhì)變性、轉(zhuǎn)膜、封閉及抗體孵育、顯影及圖像分析,完成實驗。最后一步,全基因組5-hmC及5-mC的定量檢測。采用Wizard(?) Genomic DNA Purification Kit(Promega)試劑盒提取DNA,DNA的純度和濃度鑒定后,嚴(yán)格按照(Epigentek公司)MethylFlash Hydroxymethylated DNA Quantification Kit-及.MethylFlash Methylated DNA Quantification Kit操作說明書操作,檢測樣品的上樣檢測量是200ng。3.采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件(Statistical Package for the Social Sciences),數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(x±E)表示。組間數(shù)量資料比較采用t-test或One-way ANOVA,方差不齊時采用Welch近似方差檢驗,雙變量相關(guān)分析。設(shè)雙側(cè)檢驗,P0.05為差異顯著水平,P0.01為差異極顯著水平。[研究結(jié)果]1.采用熒光定量PCR技術(shù)檢測TET1, TET2, TET1 mRNA在人類早孕絨毛組織中的表達情況,TET1, TET2, TET1的表達均會隨著孕周的增加而下降,尤以TET3下降明顯(6周vs.7周,P0.05；6周vs.8周,P0.05)。三種TET mRNA均在孕6周的絨毛組織中表達是最高的,與孕8周組相比有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義。2.我們應(yīng)用Western-bloting的方法驗證了TET1, TET2, TET3蛋白在人類早孕絨毛組織中的表達,進一步證實了TET mRNA水平上的實驗結(jié)果。實驗過程中所應(yīng)用標(biāo)本與RT-PCR中一致,TET1,TET2,TET3蛋白的表達同樣會隨著孕周的增加而下降,而且在各組之間的表達存在著明顯的統(tǒng)計學(xué)差異。在孕6周組,TET1,TET2,TET3蛋白的表達明顯高于孕7周組和孕8周組。在7周和8周的組間比較上未得到統(tǒng)計學(xué)意義的結(jié)果。3.5-hmC在早孕絨毛組織中的表達與TET酶的表達趨勢比較一致,隨著孕周數(shù)的增加,表達量下降。以孕6周的絨毛組織中表達最高(6周vs 7周,P0.01；6周vs 8周,P0.01)。同時,5-mC在早孕絨毛組織中的表達也會隨著TET酶的表達量的減少而呈下降趨勢(6周vs 8周,P0.01；7周vs 8周,P0.01),在孕6周時表達量顯著高于其它孕周數(shù)(P0.05)。4.相關(guān)分析的結(jié)果顯示：在人類早孕絨毛組織中,TET3 mRNA的表達和5-hmC定量有相關(guān)性(r=0.450,P0.05)。但TET2和TET3的表達與5-hmC定量的相關(guān)性均不顯著(P0.05)。[研究結(jié)論]1.本研究發(fā)現(xiàn)TET1,TET2,和TET3 mRNA在人類早孕期絨毛組織中的表達是隨著孕周的增加而逐步下降的(6周,7周,8周)。顯而易見,在這三個實驗組的比較中,TET1,TET1,和TET3 mRNA在孕6周時表達最旺盛。同樣的標(biāo)本,TET蛋白的半定量檢測同時證明了這一下降趨勢的存在。2. TET1、TET2、TET3在早期妊娠發(fā)育過程中確有在母胎界面的絨毛組織中表達,并且在孕6-8周的階段,有逐漸減弱的趨勢。3個TET蛋白在早孕絨毛組織內(nèi)可能發(fā)揮著將5-mC轉(zhuǎn)變成5-hmC的作用。3.5-hmC及5-mC在早孕絨毛組織中的表達與TET酶的表達趨勢比較一致,隨著孕周數(shù)的增加,表達量下降,并以孕6周的絨毛組織中表達最高,孕8周時表達最低。由此猜測,在早期妊娠自孕6周進展到孕8周的階段的絨毛組織中,無論是甲基化的過程,亦或是去甲基化的過程都在減弱。4.在人類早孕絨毛組織中,TET3的表達和5-hmC定量有顯著相關(guān)性。但TETl和TET2的表達與5-hmC定量相關(guān)性不大。我們猜測在人類早期絨毛組織的去甲基化過程中,TET3可能發(fā)揮了更為重要的作用。5.我們僅僅分析了TET、5-mC、5-hmC在早期妊娠絨毛組織(孕6-8周)的表達量及表達趨勢,并且很難擴充研究組,如對早孕期各種孕周數(shù)的研究。第二部分TET酶的缺乏及相關(guān)的去甲基化異常與人類早期自然流產(chǎn)的相關(guān)性研究[研究目的]表觀遺傳在著床前后的早期胚胎發(fā)育中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)：PEG1、H19、IGF2、GRB10等印記基因甲基化程度的改變可能與自然流產(chǎn)的發(fā)生相關(guān),甲基化轉(zhuǎn)移酶3A(DNAmethyltransferases DNMT3A)基因啟動子區(qū)單核苷酸多態(tài)性(SNP)在早/中期妊娠丟失中可能發(fā)揮了一定作用。另有文獻報道,與正常早孕相比,在早孕流產(chǎn)患者的絨毛中DNMT1表達量顯著減少同時DNA甲基化水平明顯下降,提示甲基化的異�？赡芤l(fā)胚胎停止發(fā)育、導(dǎo)致自然流產(chǎn)。DNA甲基化在胚胎早期發(fā)育中具有重要意義。但是關(guān)于胚胎發(fā)育過程中,DNA去甲基化的啟動機制和作用機理還需進一步地研究,以及TET酶相關(guān)的去甲基化通路缺陷是否引起人類早期妊娠丟失不甚明了。本部分?jǐn)M從不同時期、不同類型停止發(fā)育的早孕絨毛組織的甲基化/去甲基化動態(tài)變化的角度,研究TET蛋白,5-mC,5-hmC在人類早孕絨毛組織中全基因組的變化模式,分析去甲基化與自然流產(chǎn)的病因和發(fā)病機制之間的關(guān)系。[研究方法](1)本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn),標(biāo)本收集經(jīng)患者知情同意。2012年9月至2013年5月于廣州醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科門診收集：自愿選擇終止妊娠婦女的正常絨毛31例。2012年5月至2013年5月于廣州市婦女兒童醫(yī)院婦產(chǎn)科門診收集：早期胚胎停止發(fā)育的絨毛30例。絨毛樣本均為孕6-8+6周,母齡18-42歲。收集人早孕期絨毛組織分為兩組：一組為胚胎停育,作為研究組(EPL組)；二組為正常妊娠,作為對照組。胚胎停育的標(biāo)本又根據(jù)胚胎發(fā)育情況分為3個亞組：空囊型(GS,n=9),②有胚芽無胎心型(EM,n=18)③有胎心后停育型(FH, n=3)。為與正常妊娠組相匹配,再根據(jù)不同發(fā)育時期分為3個亞組：①6周(n=7),②7周(n=15),③8周(你=8)。(2) 獲取絨毛組織后,即用生理鹽水漂洗2-3次以去除絨毛組織上帶有的血跡,采用50m1無菌離心管收集絨毛組織,內(nèi)置1 xPBS溶液,顯微鏡下挑選、剪取絨毛組織,分裝入1.5ml EP管內(nèi),凍存-80°。第一步,流產(chǎn)組織的絨毛取部分行G顯帶染色體分析。第二步,TET mRNA的檢測：應(yīng)用BiooPure RNA Isolation Reagent (Bioo, USA)提取絨毛組織RNA, RNA的純度和濃度鑒定后行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(Fermentas K1622)嚴(yán)格按照試劑操作說明)。第三步,Western-bloting方法用于TET蛋白表達的驗證：絨毛組織組織總蛋白的提取,蛋白質(zhì)變性、轉(zhuǎn)膜、封閉及抗體孵育、顯影及圖像分析,完成實驗。第四步,免疫組化的方法再次驗證TET。第五步,全基因組5-hmC及5-mC的定量檢測。采用Wizard(?) Genomic DNA Purification Kit (Promega)試劑盒提取DNA, DNA的純度和濃度鑒定后,嚴(yán)格按照(Epigentek公司)MethylFlash Hydroxymethylated DNA Quantification Kit.及MethylFlash Methylated DNA Quantification Kit操作說明書操作,檢測樣品的上樣檢測量是200ng。(3) 采用t-test或One-way ANOVA進行組間數(shù)量資料比較,方差不齊時采用Welch近似方差檢驗。設(shè)雙側(cè)檢驗,P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義,P0.01為差異極顯著水平。應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件,數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(x±E)表示。[研究結(jié)果]1.正常妊娠組的TET1,TET2,TET3 mRNA水平均高于EPL組(TET1 P0.01, TET2 P0.01, TET3 P0.05)。也就是說,在孕6-8周的早期妊娠中,與正常妊娠相比,流產(chǎn)的絨毛組織中三種TETmRNA的含量有所下降。在EPL組中,以孕周數(shù)作為分組依據(jù)的三個亞組中,三種TETmRNA的表達在孕6周,7周,8周組之間比較無顯著差別(P0.05)。另外根據(jù)臨床類型分組中,無論是在空囊型的早孕絨毛,有胚芽無胎心型流產(chǎn)的早孕絨毛,還是已有胎心后停育型的流產(chǎn)絨毛組織中,：TET1,TET2,TET3 mRNA表達均未見差別。2. TET1,TET2和TET3蛋白的表達隨著孕周的增加而下降,以EPL組的明顯減弱。在孕6周組中,TET1,TET2,TET3蛋白的表達明顯高于孕7周組和孕8周組以及EPL組。免疫組化圖片顯示：TET1,TET2和TET3主要表達于絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞,呈以細(xì)胞漿為主的表達,細(xì)胞核為陰性反應(yīng)。仍然是表達在孕6周時最為明顯。3. 5-mC在正常妊娠的絨毛組織中表達低于在流產(chǎn)的絨毛組織中的表達,差異達到顯著水平。但是,5-hmC在絨毛組織中的表達量整體偏低,流產(chǎn)組與對照組的比較無差別。4.根據(jù)染色體正常與否又將病理組分成2個亞組：染色體正常組(N組,n=16)和染色體異常組(A組,n=11)。將自然流產(chǎn)組絨毛的TET1,TET2,TETS mRNA及5-hmC and 5-mC檢測數(shù)據(jù)在染色體正常組與染色體異常組之間進行非配對檢驗分析,結(jié)果均不顯著(P0.05)。[研究結(jié)論]1.與正常妊娠相比,TET1,TET2, TET3 mRNA在流產(chǎn)組中表達量明顯降低,western-bloting和免疫組化的蛋白檢測方法同時證明了這種趨勢的存在。2.我們成功的完成了絨毛組織中TET酶的Western-bloting和免疫組化實驗,進一步驗證了TET酶在人類早孕絨毛組織中是確實存在的,也就是說在早孕期間的母胎界面,存在著去甲基化的過程。在免疫組化的圖片上可以看到TET表達在滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞漿內(nèi),無論是細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞還是合體滋養(yǎng)細(xì)胞,均可見TET的富集。3.TET酶的缺乏與人類早期自然流產(chǎn)的發(fā)生有一定相關(guān)性,TET在絨毛組織內(nèi)可能發(fā)揮著將5-mC轉(zhuǎn)變成5-hmC或是其他產(chǎn)物的作用。4.流產(chǎn)組與正常組對比,絨毛組織中TET酶表達量的降低,5-mC的表達量升高差異顯著,而5-hmC在絨毛組織中的表達量整體偏低,無變化。流產(chǎn)的絨毛細(xì)胞發(fā)生了異常甲基化,同時去甲基化過程缺失。異常發(fā)育的胚胎的病理生理變化中,去甲基化狀態(tài)的改變或許只是其中的一個步驟,是流產(chǎn)發(fā)生后絨毛組織的一個病理變化過程。5.染色體異常導(dǎo)致的病例中,去甲基化的狀態(tài)沒有改變,與正常妊娠相比都處于較低水平。說明去甲基化的改變與染色體異常無直接關(guān)系。兩種不同的機制各自在流產(chǎn)發(fā)生中發(fā)揮著自身的作用。6.不足之處在于,樣本量較小,且僅在DNA水平對5-mC,5-hmC的含量進行分析,尚不能得出確切結(jié)論;若能檢測絨毛組織的整體去甲基化水平,及去甲基化芯片篩查相關(guān)基因,則結(jié)論可靠性更高、更具有說服力。
【圖文】：

邐咒巧ｍＲＮＡ表達的做一相關(guān)分析。結(jié)果顯示：在人類早孕絨毛逡逑組織中，７Ｅ巧ｍＲＮＡ的表達越高，則５－ｈｍＣ的水平也越高，而二者有線性相關(guān)逡逑性（ｒ＝０．４５０，b6＜０．０５）。但ＴＥＴ２和ＴＥＴ３的表達與５－ｈｍＣ定量均無線性相關(guān)關(guān)系逡逑ＣＰ＞０．０５，Ｐ＞０．０５）。圖１－２示ＴＥＴ３隨和５－ｈｍＣ存在相關(guān)，，但相關(guān)系數(shù)不大。逡逑

著明顯的統(tǒng)計學(xué)差異（表２－３）。在孕６周組中，ＴＥＴ１，ＴＥＴ２，ＴＥＴ３蛋白的表逡逑達明顯高于孕７周組和孕８周組Ｗ及Ｅ化組。另附圖２－４，流產(chǎn)組中不同孕周分組逡逑的ＴＥＴ蛋白表達情況，圖２－５根據(jù)流產(chǎn)類型分組中不同發(fā)育情況分姐的ＴＥＴ蛋白逡逑表達情況。逡逑
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R714.21


本文編號：2536801