發(fā)布時(shí)間：2019-09-02 11:06

【摘要】：研究背景與目的：胚胎植入是指從胚泡著床到胎盤形成的一系列復(fù)雜的生理過(guò)程。在這一過(guò)程中，胚胎發(fā)育到胚泡階段開始著床，子宮內(nèi)膜蛻膜化后增殖分化到容受性狀態(tài)，胚胎和母體間相互協(xié)作，共同完成。多種細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子和激素等作用于該過(guò)程。胚胎植入失敗是臨床上早期流產(chǎn)和輔助生殖技術(shù)（IVF-ET）中移植失敗的關(guān)鍵因素。 目前對(duì)于胚胎植入過(guò)程分子機(jī)制的研究尚不是十分清楚。在母體方面，一方面蛻膜化子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞與多種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和激素作用，調(diào)節(jié)胚胎絨毛外細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞多種基因的表達(dá)，其中前列腺素E2可以通過(guò)促進(jìn)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的蛻膜化促進(jìn)胚胎植入。另一方面蛻膜化后的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的生物學(xué)特性的增強(qiáng)，即遷移和侵襲能力提高，與滋養(yǎng)層細(xì)胞的遷移和侵襲可以形成良好的互動(dòng)，促進(jìn)胚泡的植入。因此，子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的蛻膜化及遷移和侵襲的能力對(duì)胚胎的植入過(guò)程起著非常重要的作用。 硫化氫（hydrogen sulfide，H2S）是體內(nèi)的氣體信號(hào)分子，在多種生理病理過(guò)程中發(fā)揮重要的功能。研究表明H2S可以作為炎性因子參與炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)血管平滑肌以及神經(jīng)系統(tǒng)的功能，同時(shí)在女性的生殖系統(tǒng)中發(fā)揮重要的作用。 本實(shí)驗(yàn)從胚胎植入過(guò)程中母兒界面的母面入手，將H2S與胚胎植入的過(guò)程相聯(lián)系，研究H2S對(duì)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化及其生物學(xué)特性的影響因素，探討其對(duì)胚胎植入的作用。 研究?jī)?nèi)容及方法：1、H2S對(duì)人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化的作用。臨床上收集人子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本，免疫組化檢測(cè)H2S合成酶胱硫醚-β-合成酶（cystathionine-β-synthase，CBS）和胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionine-γ-lyase，CSE）的表達(dá)情況，結(jié)果表明在人子宮內(nèi)膜組織的基質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞中均可表達(dá)H2S合成酶CBS和CSE。說(shuō)明人的子宮內(nèi)膜組織可能能夠自體合成H2S。我們對(duì)人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行原代分離、培養(yǎng)和鑒定，構(gòu)建人體外子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的蛻膜化模型。用Western-blot方法檢測(cè)H2S合成酶CBS和CSE在人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)CBS和CSE在蛻膜化過(guò)程中表達(dá)增加，CBS的增加更為明顯，提示H2S參與了人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的蛻膜化過(guò)程。為進(jìn)一步研究H2S對(duì)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化的作用，在子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的蛻膜化過(guò)程中分別加入了H2S合成酶CBS的抑制劑AOAA，H2S合成酶CSE的抑制劑PAG，抑制H2S合成，Real-Time PCR方法檢測(cè)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化程度的標(biāo)志性分子催乳素(prolactin, PRL)和胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-1(insulin-like growth factor binding protein1,IGFBP1)的表達(dá)，ELISA法檢測(cè)其在細(xì)胞上清液中的表達(dá)情況，，結(jié)果提示，CBS的合成受到抑制后，子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的蛻膜化程度降低，在給予外源性H2S供體NaSH后可以逆轉(zhuǎn)AOAA對(duì)蛻膜化的抑制效應(yīng)。CSE的合成受到抑制后，子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的蛻膜化程度無(wú)明顯改變。同時(shí)，我們?cè)谕懩せ杏肅BS siRNA轉(zhuǎn)染子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞，干擾CBS的表達(dá)，用CSE siRNA轉(zhuǎn)染子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞，干擾CSE的表達(dá)，減少的H2S合成，Real-TimePCR和ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞和上清液中PRL和IGFBP1的表達(dá)，結(jié)果表明CBS的表達(dá)被干擾后，子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的蛻膜化程度降低，外源性H2S供體NaSH后可以逆轉(zhuǎn)CBS siRNA對(duì)蛻膜化的抑制效應(yīng)。CSE siRNA對(duì)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的蛻膜化程度無(wú)明顯改變。以上提示H2S可以對(duì)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化起到促進(jìn)作用，其中H2S合成酶起到了主要的作用。 2、H2S對(duì)人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化中前列腺素E2生成的調(diào)節(jié)。在子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化過(guò)程中加入H2S合成酶CBS的抑制劑AOAA，H2S合成酶CSE的抑制劑PAG，抑制H2S合成，Western-blot方法檢測(cè)前列腺素合成酶（環(huán)氧化物水解酶cyclo-oxygen-ase,COX-2）的表達(dá)情況，結(jié)果表明CBS被抑制后COX-2的表達(dá)下降，給予外源性H2S后可以逆轉(zhuǎn)這一效應(yīng)。同時(shí)用ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞上清液中前列腺素E2（PGE2）的生成，提示PGE2的合成減少。CSE被抑制后COX-2以及PGE2的生成無(wú)明顯改變。同樣我們?cè)谕懩せ杏肅BS siRNA轉(zhuǎn)染子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞，干擾CBS的表達(dá)，Western-blot方法檢測(cè)到COX-2的表達(dá)降低，同時(shí)ELISA方法檢測(cè)到細(xì)胞上清液中PGE2的合成減少。用CSE siRNA轉(zhuǎn)染子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞，干擾CSE的表達(dá)后COX-2以及PGE2的生成無(wú)明顯改變。以上結(jié)果提示H2S促進(jìn)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化過(guò)程中前列腺素合成酶COX-2的表達(dá)及PGE2的合成。由于PGE2可以促進(jìn)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的蛻膜化，我們認(rèn)為H2S可能通過(guò)上調(diào)PGE2的合成促進(jìn)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化。 3、H2S對(duì)人蛻膜化子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。在子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化過(guò)程中加入H2S合成酶CBS抑制劑AOAA，H2S合成酶CSE的抑制劑PAG，使H2S合成減少，利用MTT法檢測(cè)AOAA和PAG對(duì)細(xì)胞增殖的影響，同時(shí)我們用CBS siRNA和CSE siRNA轉(zhuǎn)染子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞，同樣利用MTT法檢測(cè)其細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果表明在子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化過(guò)程中，減少H2S的生成，對(duì)細(xì)胞的增殖無(wú)明顯影響。我們利用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)H2S對(duì)蛻膜化的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，結(jié)果表明CBS合成受到抑制后，子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞遷移和侵襲能力下降，CSE合成受到抑制后，子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞遷移和侵襲能力無(wú)明顯改變。同時(shí)我們用CBS siRNA和CSE siRNA轉(zhuǎn)染子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞，干擾CBS和CSE表達(dá)，結(jié)果表明CBS被干擾后蛻膜化的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞遷移和侵襲能力降低，CSE被干擾后蛻膜化的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞遷移和侵襲能力無(wú)明顯改變。以上結(jié)果提示H2S可以促進(jìn)蛻膜化人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的遷移和侵襲能力。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)在人體外子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化模型的基礎(chǔ)上，研究了H2S對(duì)人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化及其生物學(xué)特性的作用。結(jié)果表明H2S可能通過(guò)上調(diào)前列腺素E2的合成促進(jìn)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化，H2S可以增強(qiáng)蛻膜化子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的遷移和侵襲能力。進(jìn)一步表明了H2S對(duì)胚胎植入過(guò)程具有促進(jìn)作用。本實(shí)驗(yàn)為臨床上研究胚泡著床失敗導(dǎo)致的早期自然流產(chǎn)和IVF-ET術(shù)移植失敗提供一定的理論基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖 1-2.人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞普通光學(xué)顯微鏡形態(tài)學(xué)觀察Fig 1-2. Cytomorphological examination of endometrial stromal cell in human.Images are at 100× and 200× magnification.（二）細(xì)胞免疫化學(xué)染色鑒定為了驗(yàn)證我們?cè)囵B(yǎng)的人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞，我們使用免疫熒光化學(xué)染色鑒定人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞可特異地表達(dá)波形蛋白。我們利用 PE 標(biāo)記鼠抗人波形蛋白抗體對(duì)其行鑒定，如圖 1-3 所示:（A，D）細(xì)胞用 DAPI 進(jìn)行細(xì)胞核染色，熒光下顯示為藍(lán)色；（B，E）分別為使用 PE 標(biāo)記鼠抗人 IgG1 抗體（同型對(duì)照）和 PE 標(biāo)記鼠抗人波形蛋白抗體對(duì)細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行染色，基質(zhì)細(xì)胞可以被 PE 標(biāo)記鼠抗人波形蛋白抗體染成紅色，而同型抗體 IgG1 組，顯示為陰性，證明原代分離的基質(zhì)細(xì)胞因?yàn)樘禺惖谋磉_(dá)波形蛋白被激發(fā)紅色熒光，而不是因?yàn)榫哂邢嗤?IgG 被激發(fā)紅色熒光；（C，F(xiàn)）為圖 A+B，圖 D+E 的疊圖。人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞純度=波形蛋白標(biāo)記為紅色的總細(xì)

圖 1-3.子宮內(nèi)膜異位基質(zhì)細(xì)胞免疫熒光鑒定結(jié)果Fig 1-3. Representative photomicrographs of the fluoroimmunoassay for vimentin in the isolated endometrial stromal cells. The cells were stained with DAPI (A,D), mouse IgG1 PE (B) and mouse-anti-human vimentin PE (E). The graphs (A and B; D and E) were merged on the right (C; F) respectively.三、人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞體外蛻膜化模型的建立我們?yōu)榱藰?gòu)建人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的體外蛻膜化誘導(dǎo)模型，對(duì)原代培養(yǎng)的人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的 P1 代進(jìn)行蛻膜化誘導(dǎo)，誘導(dǎo)方法為加入 10-7M MPA 和 5×10-4M 8-Br-cAMP(M+A)。結(jié)果顯示：圖 1-5(A)為原代培養(yǎng)的人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞呈梭狀，分散型生長(zhǎng)。(B)為蛻膜化誘導(dǎo) 72h 后的內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞增殖，典型的梭狀形態(tài)消失，細(xì)胞核變大。均在普通光學(xué)顯微鏡下 100×下觀察。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R714.8

【參考文獻(xiàn)】

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1 杜淑旭;杜軍保;唐朝樞;;內(nèi)源性二氧化硫及其衍生物的生理作用研究進(jìn)展[J];北京大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2006年03期

2 孟祥艷,魯平,凌亦凌,張曉靜,韋鵬,周曉紅,黃新莉;氣體信號(hào)分子硫化氫在脂多糖誘導(dǎo)大鼠肺急性炎癥反應(yīng)中的作用[J];河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2005年02期

本文編號(hào)：2530889