【摘要】：目的 研究在單獨使用siRNA或單一光動力增效劑的基礎上，siRNA和單一光動力增效劑聯(lián)合應用，以增強基于5－氨基酮戊酸的光動力診斷（5-aminolevulinic acid photodynamicdiagnosis，ALA-PDD）的敏感性，減少ALA用量，避免與其有關的毒副作用。并為進一步應用多種光動力增效劑，或siRNA同多種光動力增效劑聯(lián)合應用，提高卵巢癌細胞的熒光成像靈敏度提供實驗依據。 方法 1膠原酶消化法分離人卵巢成纖維HOF細胞，常規(guī)培養(yǎng)人卵巢癌SK-OV-3細胞及HOF細胞。 2熒光顯微鏡檢測ALA對SK-OV-3細胞的最佳作用時間及最小有效濃度。 3以Lipofectamine RNAiMAX介導亞鐵螯合酶（ferrochelatase，FECH）-siRNA轉染，敲減SK-OV-3細胞的FECH，應用RT-qPCR、western blot檢測mRNA和蛋白質水平的變化，熒光顯微鏡檢測處理后的SK-OV-3細胞與HOF細胞內原卟啉Ⅸ（protoporphyrin，PpⅨ）熒光強度。 4熒光顯微鏡檢測去鐵胺（deferoxamine，DFO）、乙二胺四乙酸二鈉鈣（Ethylenediaminetetraacetic Acid Calcium Disodium Salt Hydrate，EDTA-Na2Ca）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）分別聯(lián)合ALA在SK-OV-3細胞和HOF細胞出現PpⅨ熒光的最佳條件及三者的增效作用差異，比較siRNA與單一光動力增效劑對SK-OV-3細胞PpⅨ蓄積和熒光成像敏感性的作用。 結果 10.3mMALA可誘導SK-OV-3細胞內出現PpⅨ熒光，在誘導的0h至6h內PpⅨ熒光隨時間的延長而增強（P0.05），6h至9h為平臺期（P0.05），9h后逐漸減弱（P0.05）。 20.3mMALA作用6h，SK-OV-3細胞的PpⅨ熒光強度略強于HOF細胞（P0.01）。 3siRNA敲減SK-OV-3細胞后，FECH-mRNA降至0.05±0.01倍（P0.01），FECH降至0.20±0.07倍（P0.01），與ALA聯(lián)合應用后細胞PpⅨ熒光明顯增強（P0.05）；相比之下HOF細胞在轉染后其PpⅨ熒光強度無明顯變化（P0.05）。 4DFO單獨處理SK-OV-3細胞不能增強PpⅨ熒光（P0.05），但聯(lián)合應用ALA可提高熒光強度（P0.01），其濃度在5mM至30mM熒光強度基本相似（P0.05），作用時間為5h時，PpⅨ熒光最強（P0.05）。 5EDTA-Na2Ca單獨處理SK-OV-3細胞不能增加其PpⅨ熒光強度（P0.05），聯(lián)合應用ALA則可增加熒光強度（P0.01），且在0mM至125mM之間細胞的PpⅨ熒光強度與濃度呈正相關（P0.05），，作用時間在2h至5h時，熒光強度無明顯變化（P0.05）。 6DMSO單獨作用于SK-OV-3細胞不能增強PpⅨ熒光強度（P0.05），聯(lián)合應用ALA時則有增強作用（P0.01），DMSO的最適濃度為6%（P0.05），最佳作用時間為3h（P0.05）。 7對HOF細胞而言，DFO、EDTA-Na2Ca、DMSO各自聯(lián)合ALA均不能增強細胞的PpⅨ熒光（P0.05）；對SK-OV-3細胞而言，以上三者均能增強PpⅨ熒光強度，三者之間無顯著差異（P0.05），但顯著高于對HOF細胞的作用（P0.01）。 8EDTA-Na2Ca或DMSO聯(lián)合siRNA較三者單獨應用更加有效增強SK-OV-3細胞的PpⅨ熒光（P0.05）；DFO聯(lián)合siRNA與單獨使用siRNA相比，SK-OV-3細胞的PpⅨ熒光強度無明顯增強（P0.05）。 結論 1ALA誘導SK-OV-3細胞熒光顯微鏡下產生PpⅨ熒光的最佳時間為6h，最低有效濃度為0.3mM；在此條件下SK-OV-3細胞比HOF細胞產生更強的PpⅨ熒光。 2Lipofectamine RNAiMAX介導FECH-siRNA轉染SK-OV-3細胞后可顯著敲減FECHmRNA和蛋白質的表達，并增強聯(lián)用低劑量ALA時的PpⅨ熒光強度；但并不增強HOF細胞的PpⅨ熒光強度。 3DFO、EDTA-Na2Ca、DMSO分別聯(lián)合ALA均能增強SK-OV-3細胞的PpⅨ熒光強度，但均不能增加HOF細胞的PpⅨ熒光強度。 4siRNA聯(lián)合EDTA-Na2Ca或DMSO時，與ALA存在協(xié)同效應，而siRNA聯(lián)合DFO不能進一步增強ALA的作用。 5本研究證實不同作用靶點方法的聯(lián)合應用能更有效地提高卵巢癌細胞的PpⅨ熒光強度，應用光動力增效劑可以擴大卵巢癌細胞與正常細胞的熒光差異，從而使ALA的靶向性更加明顯且對正常細胞的損害降至更低水平。
【圖文】：

血紅[6]

各實驗組平均OD值以ALA-PpⅨ熒光標準曲線校準后可見ALA作用時間在2～6h之間時，PpⅨ特異性紅色熒光的強度隨作用時間的延長而增強，其各組之間的差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。作用時間在 6～9h 之間時，PpⅨ熒光的強度不再隨作用時間的延長而增強，各組間沒有統(tǒng)計學差異（P＝0.226）。作用時間超過 9h 后 PpⅨ熒光強度隨作用時間的延長出現明顯下降，10h 組與 6～9h 各實驗組間的存在統(tǒng)計學差異（P<0.05）（圖 1－4）。
【學位授予單位】：暨南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R737.31

【參考文獻】

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1 劉麗媛;張鳳奎;;繼發(fā)鐵過載研究進展[J];中國實用內科雜志;2009年06期

2 夏育民;黃櫻櫻;林隆德;劉小明;江珊;熊臘元;;A Comparative Study on the Enhancement Efficacy of Specific and Non-specific Iron Chelators for Protoporphyrin Ⅸ Production and Photosensitization in HaCat Cells[J];Journal of Huazhong University of Science and Technology(Medical Sciences);2009年06期

3 Manuel Mu濼oz;Isabel Villar;José Antonio García-Erce;;An update on iron physiology[J];World Journal of Gastroenterology;2009年37期

4 劉容容;;鐵過載概述及口服祛鐵新藥地拉羅司[J];中國新藥雜志;2011年22期

5 胡小輝;李建文;;RNA干擾技術在乳腺癌治療中的研究進展[J];中華乳腺病雜志(電子版);2013年01期

本文編號：2530751