發(fā)布時間：2019-06-15 04:12

【摘要】：背景與目的 自1978年首例試管嬰兒路易斯·布朗在英國誕生之后，輔助生殖技術(shù)(Assisted reproductive teachnology,ART）已發(fā)展30余年，迄今為止已有約四百萬輔助生殖技術(shù)子代誕生。流行病學(xué)調(diào)查顯示：近年來每年約兩百萬ART子代誕生。由于ART是首個未經(jīng)臨床安全性評估而直接應(yīng)用于臨床治療的技術(shù)，其安全性受到人們越來越多的關(guān)注。文獻(xiàn)報道：ART子代不良妊娠結(jié)局如自然流產(chǎn)、低出生體重兒、早產(chǎn)、胎兒畸形、圍產(chǎn)期死亡及腦癱等的發(fā)生率也逐漸增加。目前表觀遺傳學(xué)研究已成為ART子代安全性研究研究的焦點(diǎn)，認(rèn)為ART的體外操作過程可能干擾子代印記基因的表達(dá)，特別是與生長發(fā)育相關(guān)的印記基因。大量文獻(xiàn)報道：ART妊娠可增加子代患普-威綜合癥(Prader-willi syndrome,PWS)、銀羅素綜合征（Silver-Russell syndrome, SRS)、安吉爾曼綜合癥(Angelmansyndromen,AS)、韋-伯綜合癥(Beckwith-wiedemamm,BWS)等印記疾病的風(fēng)險。因此本課題選擇與ART子代生長發(fā)育密切相關(guān)的印記基因PEG10、L3MBTL1進(jìn)行研究，觀察目的基因在ART子代胎盤表達(dá)情況，并探討輔助生殖技術(shù)的安全性。 胎盤是胎兒在母體內(nèi)獲得營養(yǎng)及物質(zhì)交換的場所，對胎兒生長發(fā)育起重要作用。許多印記基因均表達(dá)于胎盤組織中，ART操作可能導(dǎo)致印記基因表達(dá)異常。PEG10(Paternally expressed gene10)是一父系印記基因，由Ryuich ono等在2001年利用cDNA微陣列在肝癌中所發(fā)現(xiàn)，其定位于人類7號染色體長臂2區(qū)1帶(7q21.3)，在胎盤、腦、腎臟、肝臟、卵巢及睪丸等組織內(nèi)均有表達(dá)，其編碼的蛋白與胎兒生長、胎盤形成及滋養(yǎng)細(xì)胞分化密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)：敲除小鼠胚胎中PEG10基因會導(dǎo)致小鼠胎盤發(fā)育異常，并增加流產(chǎn)率及早期胚胎死亡率。PEG10在自然流產(chǎn)、難免流產(chǎn)組織中均呈低表達(dá)狀態(tài)，在肝癌及胃癌組織中呈高表達(dá)。父系印記基因L3MBTL1(Paternally expressed gene L3MBTL1)位于20號染色體長臂13區(qū)12帶(20q13.12)上，在胎盤、造血祖細(xì)胞及腫瘤組織中表達(dá)，主要參與和維持細(xì)胞正常有絲分裂，其編碼的蛋白可抑制腦部惡性腫瘤的生長。在白血病細(xì)胞、異常增生的骨髓細(xì)胞中呈低表達(dá)甚至無表達(dá)。敲除小鼠胚胎中L3MBTL1基因可導(dǎo)致胚胎干細(xì)胞向滋養(yǎng)外胚層分化障礙，影響胎盤及胚胎正常發(fā)育。 我們前期研究應(yīng)用實(shí)時熒光定量PCR(QRT-PCR)技術(shù)檢測自然妊娠子代胎盤與ART子代胎盤中印記基因PEG10、L3MBTL1mRNA表達(dá)水平的變化；應(yīng)用甲基化特異性PCR技術(shù)（MSP）檢測基因PEG10、L3MBTL1甲基化狀態(tài)并作一比較，結(jié)果顯示：ART組胎盤組織中印記基因PEG10mRNA表達(dá)與自然妊娠組胎盤相比，其表達(dá)有上調(diào)趨勢；而印記基因L3MBTL1mRNA在ART組胎盤組織中表達(dá)與自然妊娠組比較呈下調(diào)趨勢；ART組胎盤中PEG10啟動子區(qū)甲基化陽性率均低于自然妊娠組， ART組胎盤組織中L3MBTL1啟動子區(qū)甲基化陽性率均高于自然妊娠組。認(rèn)為ART組胎盤組織中PEG10、L3MBTL1異常表達(dá)可能與母體及子代出生不良妊娠結(jié)局有關(guān)。本研究后續(xù)上述實(shí)驗(yàn)，我們擬采用免疫組化法(immunohistochemistry,IHC)和免疫印跡法(Western Blotting,WB)對印記基因PEG10、L3MBTL1蛋白表達(dá)進(jìn)行研究，明確其組織學(xué)定位，并從蛋白水平探討輔助生殖技術(shù)對上述蛋白表達(dá)的影響。 材料和方法 1.收集30例ART來源的胎盤組織和33例自然妊娠來源的胎盤組織，對患者基本情況及妊娠結(jié)局進(jìn)行比較。 2.對胎盤組織行常規(guī)HE染色，利用光學(xué)顯微鏡觀察并比較兩組不同來源的胎盤組織形態(tài)學(xué)上的差異。 3.利用免疫組化技術(shù)比較ART組胎盤與自然妊娠組胎盤印記基因PEG10、L3MBTL1的組織學(xué)定位及半定量分析上述兩個基因蛋白表達(dá)的差異。 4.利用Western Blotting技術(shù)定量分析ART組胎盤與自然妊娠組胎盤印記基因PEG10、L3MBTL1蛋白表達(dá)的差異。 5.利用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料（對稱分布）用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。 結(jié)果 1.兩組產(chǎn)婦的年齡、孕期增重、臍帶長度等方面相比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。ART組出生子代體重及身長、胎盤重量均低于自然妊娠組子代，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2.兩組胎盤行常規(guī)HE染色結(jié)果顯示：ART組胎盤和自然妊娠組胎盤均存在典型的絨毛結(jié)構(gòu)，胎兒血管豐富，無明顯鈣化及水腫，少量炎細(xì)胞浸潤，胎盤結(jié)構(gòu)基本正常。 3.免疫組化顯示：PEG10、L3MBTL1蛋白在兩組胎盤組織內(nèi)均有表達(dá)，且均定位于胎盤間質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)中，在胞核中不表達(dá)。PEG10蛋白在ART組子代胎盤組織中表達(dá)有增高趨勢，，與自然妊娠子代胎盤組織相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。L3MBTL1蛋白在ART子代胎盤組織中呈下降趨勢，與自然妊娠子代胎盤組織中表達(dá)相比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 4. Western Blotting顯示：各樣本中的PEG10均在55kDa及37kDa處出現(xiàn)目的蛋白及內(nèi)參蛋白（GAPDH），各樣本中的L3MBTL1均在84kDa及37kDa處出現(xiàn)目的蛋白及內(nèi)參蛋白（GAPDH）。印記基因PEG10、L3MBTL1蛋白表達(dá)規(guī)律與前期研究的mRNA表達(dá)規(guī)律基本一致，即ART子代胎盤組織中PEG10與自然妊娠相比呈增加趨勢，ART子代胎盤組織中L3MBTL1與自然妊娠相比呈下降趨勢。 結(jié)論 1、印記基因PEG10、L3MBTL1在正常胎盤組織中均有表達(dá)，認(rèn)為兩者均參與胎盤的形成及發(fā)育，并參與正常妊娠的維持； 2、印記基因PEG10在ART子代胎盤組織中處于高水平狀態(tài)，而印記基因L3MBTL1在ART子代胎盤組織中處于低水平狀態(tài)，可能會增加ART子代出生不良結(jié)局的風(fēng)險。
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【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R714.8

【參考文獻(xiàn)】

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1 王凱;樸云峰;丁大勇;馮野;;印跡基因PEG10在胃腺癌組織中的表達(dá)及意義[J];吉林大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2008年02期

2 齊魯;郝嬋娟;夏紅飛;馬旭;孫大光;;人先天性神經(jīng)管畸形胎盤印跡基因甲基化狀態(tài)的研究[J];中國計(jì)劃生育學(xué)雜志;2013年02期

3 黃錦;林菊生;董旭e

本文編號：2499956