發(fā)布時間：2019-06-12 16:14

【摘要】：宮頸癌是引發(fā)發(fā)展中國家婦女高死亡率的一個主要原因,嚴重影響了全球女性健康。人乳頭瘤病毒(human papillomavirus, HPV)的持續(xù)感染是誘發(fā)宮頸癌的主要病因,經鑒定HPV的DNA存在于99%以上的宮頸癌患者體內。HPV原癌蛋白E6、E7相互作用使得主要細胞調節(jié)蛋白功能失活,從而干擾細胞生長、分化、凋亡,導致細胞過度增殖引起癌變；通常將E6、E7作為宮頸癌免疫治療的靶抗原。目前預防宮頸癌的疫苗已問世,預防性疫苗的出現可以降低世界范圍內宮頸癌的發(fā)生,但是對于已發(fā)宮頸癌無治療性作用。因此,宮頸癌治療性疫苗的研究顯得尤為重要。 單核細胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes,簡稱LM)是一種兼性胞內寄生菌,能直接感染抗原遞呈細胞,使所運送的外源抗原可以同時進入MHC Ⅰ類和MHC Ⅱ類抗原遞呈途徑,從而誘導強烈的CD8+T細胞和CD4+T細胞免疫應答。目前,減毒李斯特菌作為一種新型的活疫苗載體,在抗腫瘤治療中顯示出誘人的前景。 本研究以單核細胞增生性李斯特菌LM4為運送載體,通過同源重組的方法,成功地獲得能夠分泌表達密碼子優(yōu)化的HPV16E7的減毒重組李斯特菌LM4△hly::E7-1及LM4△hly::E7-3,在對這兩株疫苗候選株的生長特性、穩(wěn)定性、溶血活性及免疫反應性進行研究的基礎上,以荷瘤小鼠為實驗動物模型,對疫苗的安全性、治療性效力及抗腫瘤機制進行了相關研究。 1.表達密碼子優(yōu)化的HPV16E7的減毒重組李斯特菌的構建與鑒定 本研究首先將編碼HPV16E7蛋白的密碼子全部替換成李斯特菌偏好性密碼子,新的編碼基因命名為E7-1；并在此基礎上,將E7蛋白的24位和26位的氨基酸替換為甘氨酸(G),編碼該蛋白的基因命名為E7-3。然后以LM4為運送載體,通過同源重組的方法,將密碼子優(yōu)化了的HPV16E7基因定點整合至LM4的hly基因信號肽序列下游,獲得能夠分泌表達E7蛋白的減毒重組李斯特菌LM4△hly::E7-1及LM4△hly::E7-3。提取兩株重組菌的分泌蛋白進行Western blot分析,結果顯示,用HPV16E7單抗可在66kDa處檢測到目的條帶,表明兩株重組菌能夠分泌表達具有良好免疫反應性的融合蛋白。溶血活性試驗結果顯示,將E7-1或E7-3基因插入LM4野生株的hly下游后LLO并未完全失活,并且重組菌LM4△hly::E7-1及LM4△hly::E7-3的溶血效價均低于LM4野生株。對兩株重組細菌穩(wěn)定性測定結果顯示,E7-1、E7-3基因均能夠在重組菌基因組中穩(wěn)定存在。此外,生長曲線測定結果表明,兩株重組菌株與親本株LM4的生長趨勢基本相同,說明將E7-1基因或E7-3基因插入到LM4基因組中以后,對細菌的生長趨勢并沒有造成明顯影響。分泌表達密碼子優(yōu)化的HPV16E7蛋白的減毒重組李斯特菌的獲得,為研究其抗腫瘤特性提供了生物材料。 2.重組菌LM4△hly::E7-1及LM4△hly::E7-3在荷瘤小鼠模型中的治療性效力 評價 本研究首先對重組菌LM4△hly::E7-1及LM4△hly::E7-3的安全性進行了相關評價。重組菌動態(tài)感染實驗顯示,在對小鼠免疫后的第7天,脾臟及肝臟中的細菌均被完全清除。對重組菌免疫鼠的脾臟及肝臟進行組織切片觀察,結果顯示,兩株重組細菌感染小鼠之后,小鼠肝臟小葉間質內少量淋巴細胞浸潤,肝臟中央靜脈周圍可見中性粒細胞浸潤灶,而脾臟均無明顯病理變化；而LM4△hly對照組小鼠肝細胞發(fā)生輕度顆粒變性及水泡變性,脾臟白髓內脾小體結構增大,說明重組菌LM4△hly::E7-1及LM4△hly::E7-3對小鼠的毒力顯著降低,安全性較好。 以C57BL/6小鼠建立腫瘤模型,通過腹腔免疫途徑進行初次免疫和再次免疫,對重組菌LM4△hly::E7-1及LM4△hly::E7-3的治療性效力進行評價。結果顯示,LM4△hly組及PBS組的小鼠,隨時間的推移腫瘤逐漸生長,至第36天時,兩組中所有小鼠死亡；而免疫組小鼠經過疫苗免疫治療后,部分小鼠體內腫瘤完全消除,剩余小鼠則腫瘤生長緩慢,LM4△hly::E7-1免疫組與LM4△hly::E7免疫組相比,表現出更顯著的治療性作用。夾心ELISA實驗結果顯示,重組疫苗菌免疫小鼠后,IFN-γ分泌水平要顯著高于IL-4分泌水平,表明重組菌能誘導小鼠產生傾向于Thl型的免疫應答；LM4△hly::E7-1免疫組誘導小鼠分泌表達的IFN-γ水平顯著性高于LM4△hly::E7免疫組(P0.05),而LM4△hly::E7-3免疫組與LM4△hly::E7免疫組相比,無顯著性差異。淋巴細胞增殖實驗結果表明,在E749-57多肽刺激下,LM4△hly::E7-1免疫組與LM4△hly::E7免疫組相比,能夠誘導小鼠淋巴細胞顯著性增殖(P0.05),而LM4△hly::E7-3免疫組與LM4△hly::E7免疫組相比,無顯著性差異。另外,細胞毒性T淋巴細胞(CTL)實驗結果顯示,疫苗株均能誘導荷瘤小鼠產生較強的E7特異性的CTL活性,LM4△hly::E7免疫組產生的E7特異性的CTL效應高于其他兩免疫組,而PBS組和LM4△hly組小鼠體內沒有產生特異性的CTL活性。以上研究結果說明LM4△hly::E7-1及LM4△hly::E7-3能夠誘導小鼠產生傾向于Thl型的免疫應答及特異性CTL殺傷活性,為今后新型宮頸癌疫苗的研究提供了新思路。
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【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R737.33

【參考文獻】

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本文編號：2498137