【摘要】：宮頸癌是引發(fā)發(fā)展中國(guó)家婦女高死亡率的一個(gè)主要原因,嚴(yán)重影響了全球女性健康。人乳頭瘤病毒(human papillomavirus, HPV)的持續(xù)感染是誘發(fā)宮頸癌的主要病因,經(jīng)鑒定HPV的DNA存在于99%以上的宮頸癌患者體內(nèi)。HPV原癌蛋白E6、E7相互作用使得主要細(xì)胞調(diào)節(jié)蛋白功能失活,從而干擾細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡,導(dǎo)致細(xì)胞過度增殖引起癌變；通常將E6、E7作為宮頸癌免疫治療的靶抗原。目前預(yù)防宮頸癌的疫苗已問世,預(yù)防性疫苗的出現(xiàn)可以降低世界范圍內(nèi)宮頸癌的發(fā)生,但是對(duì)于已發(fā)宮頸癌無(wú)治療性作用。因此,宮頸癌治療性疫苗的研究顯得尤為重要。 單核細(xì)胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes,簡(jiǎn)稱LM)是一種兼性胞內(nèi)寄生菌,能直接感染抗原遞呈細(xì)胞,使所運(yùn)送的外源抗原可以同時(shí)進(jìn)入MHC Ⅰ類和MHC Ⅱ類抗原遞呈途徑,從而誘導(dǎo)強(qiáng)烈的CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞免疫應(yīng)答。目前,減毒李斯特菌作為一種新型的活疫苗載體,在抗腫瘤治療中顯示出誘人的前景。 本研究以單核細(xì)胞增生性李斯特菌LM4為運(yùn)送載體,通過同源重組的方法,成功地獲得能夠分泌表達(dá)密碼子優(yōu)化的HPV16E7的減毒重組李斯特菌LM4△hly::E7-1及LM4△hly::E7-3,在對(duì)這兩株疫苗候選株的生長(zhǎng)特性、穩(wěn)定性、溶血活性及免疫反應(yīng)性進(jìn)行研究的基礎(chǔ)上,以荷瘤小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型,對(duì)疫苗的安全性、治療性效力及抗腫瘤機(jī)制進(jìn)行了相關(guān)研究。 1.表達(dá)密碼子優(yōu)化的HPV16E7的減毒重組李斯特菌的構(gòu)建與鑒定 本研究首先將編碼HPV16E7蛋白的密碼子全部替換成李斯特菌偏好性密碼子,新的編碼基因命名為E7-1；并在此基礎(chǔ)上,將E7蛋白的24位和26位的氨基酸替換為甘氨酸(G),編碼該蛋白的基因命名為E7-3。然后以LM4為運(yùn)送載體,通過同源重組的方法,將密碼子優(yōu)化了的HPV16E7基因定點(diǎn)整合至LM4的hly基因信號(hào)肽序列下游,獲得能夠分泌表達(dá)E7蛋白的減毒重組李斯特菌LM4△hly::E7-1及LM4△hly::E7-3。提取兩株重組菌的分泌蛋白進(jìn)行Western blot分析,結(jié)果顯示,用HPV16E7單抗可在66kDa處檢測(cè)到目的條帶,表明兩株重組菌能夠分泌表達(dá)具有良好免疫反應(yīng)性的融合蛋白。溶血活性試驗(yàn)結(jié)果顯示,將E7-1或E7-3基因插入LM4野生株的hly下游后LLO并未完全失活,并且重組菌LM4△hly::E7-1及LM4△hly::E7-3的溶血效價(jià)均低于LM4野生株。對(duì)兩株重組細(xì)菌穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果顯示,E7-1、E7-3基因均能夠在重組菌基因組中穩(wěn)定存在。此外,生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果表明,兩株重組菌株與親本株LM4的生長(zhǎng)趨勢(shì)基本相同,說明將E7-1基因或E7-3基因插入到LM4基因組中以后,對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)趨勢(shì)并沒有造成明顯影響。分泌表達(dá)密碼子優(yōu)化的HPV16E7蛋白的減毒重組李斯特菌的獲得,為研究其抗腫瘤特性提供了生物材料。 2.重組菌LM4△hly::E7-1及LM4△hly::E7-3在荷瘤小鼠模型中的治療性效力 評(píng)價(jià) 本研究首先對(duì)重組菌LM4△hly::E7-1及LM4△hly::E7-3的安全性進(jìn)行了相關(guān)評(píng)價(jià)。重組菌動(dòng)態(tài)感染實(shí)驗(yàn)顯示,在對(duì)小鼠免疫后的第7天,脾臟及肝臟中的細(xì)菌均被完全清除。對(duì)重組菌免疫鼠的脾臟及肝臟進(jìn)行組織切片觀察,結(jié)果顯示,兩株重組細(xì)菌感染小鼠之后,小鼠肝臟小葉間質(zhì)內(nèi)少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),肝臟中央靜脈周圍可見中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)灶,而脾臟均無(wú)明顯病理變化；而LM4△hly對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞發(fā)生輕度顆粒變性及水泡變性,脾臟白髓內(nèi)脾小體結(jié)構(gòu)增大,說明重組菌LM4△hly::E7-1及LM4△hly::E7-3對(duì)小鼠的毒力顯著降低,安全性較好。 以C57BL/6小鼠建立腫瘤模型,通過腹腔免疫途徑進(jìn)行初次免疫和再次免疫,對(duì)重組菌LM4△hly::E7-1及LM4△hly::E7-3的治療性效力進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示,LM4△hly組及PBS組的小鼠,隨時(shí)間的推移腫瘤逐漸生長(zhǎng),至第36天時(shí),兩組中所有小鼠死亡；而免疫組小鼠經(jīng)過疫苗免疫治療后,部分小鼠體內(nèi)腫瘤完全消除,剩余小鼠則腫瘤生長(zhǎng)緩慢,LM4△hly::E7-1免疫組與LM4△hly::E7免疫組相比,表現(xiàn)出更顯著的治療性作用。夾心ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,重組疫苗菌免疫小鼠后,IFN-γ分泌水平要顯著高于IL-4分泌水平,表明重組菌能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生傾向于Thl型的免疫應(yīng)答；LM4△hly::E7-1免疫組誘導(dǎo)小鼠分泌表達(dá)的IFN-γ水平顯著性高于LM4△hly::E7免疫組(P0.05),而LM4△hly::E7-3免疫組與LM4△hly::E7免疫組相比,無(wú)顯著性差異。淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在E749-57多肽刺激下,LM4△hly::E7-1免疫組與LM4△hly::E7免疫組相比,能夠誘導(dǎo)小鼠淋巴細(xì)胞顯著性增殖(P0.05),而LM4△hly::E7-3免疫組與LM4△hly::E7免疫組相比,無(wú)顯著性差異。另外,細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,疫苗株均能誘導(dǎo)荷瘤小鼠產(chǎn)生較強(qiáng)的E7特異性的CTL活性,LM4△hly::E7免疫組產(chǎn)生的E7特異性的CTL效應(yīng)高于其他兩免疫組,而PBS組和LM4△hly組小鼠體內(nèi)沒有產(chǎn)生特異性的CTL活性。以上研究結(jié)果說明LM4△hly::E7-1及LM4△hly::E7-3能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生傾向于Thl型的免疫應(yīng)答及特異性CTL殺傷活性,為今后新型宮頸癌疫苗的研究提供了新思路。
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【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R737.33

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2498137