【摘要】：促性腺激素釋放激素(GnRH)是下丘腦-垂體-性腺軸生殖激素級(jí)聯(lián)釋放的重要調(diào)節(jié)物。Gn RH與妊娠識(shí)別、胚胎附植、妊娠維持及終止等有著直接或間接的聯(lián)系,是下丘腦-垂體-性腺軸的至關(guān)重要的促垂體激素。臨床發(fā)現(xiàn),甲狀腺素與下丘腦-垂體-性腺軸之間存在調(diào)節(jié)關(guān)容摘要系,但是確切的機(jī)制不清。通過(guò)檢測(cè)甲狀腺功能減退狀況下,大鼠下丘腦-垂體-卵巢軸激素水平變化,觀察雌性成年大鼠受孕率、流產(chǎn)率的差異,以及運(yùn)用免疫組織化學(xué)及實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定方法對(duì)各組大鼠下丘腦-垂體-卵巢軸中的Gn RH表達(dá)、Gn RH受體在下丘腦、垂體、卵巢的分布,了解Gn RH是否為甲狀腺激素調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-卵巢軸及生殖功能的核心環(huán)節(jié)。為將來(lái)甲狀腺激素與性腺激素的相互調(diào)節(jié)機(jī)制研究打下基礎(chǔ)。材料與方法甲減及妊娠大鼠動(dòng)物模型的建立實(shí)驗(yàn)步驟:106只雌性SD大鼠,隨機(jī)分為2組,正常飲用水組(n=30)及0.05%丙基硫氧嘧啶(PTU)飲用水組(n=76),誘導(dǎo)成年期甲狀腺功能減退癥大鼠模型6周。隨機(jī)從兩組中抽取5只,測(cè)定甲狀腺激素,判定甲減造模是否成功。造模成功后,進(jìn)一步從正常飲用水組隨機(jī)選取5只作為正常組(NG,n=5),PTU飲用水組中隨機(jī)選取5只作為甲減組(HG,n=5),剩余正常飲用水組中25只作為正常合籠組(n=25)及PTU飲用水組中71只作為甲減合籠組(n=71)通過(guò)雌雄2:1合籠建立妊娠模型,妊娠后分別歸為正常妊娠組(n=10)和甲減妊娠組(n=28)。沒(méi)有妊娠就歸為正常對(duì)照組和甲減組,最終單純甲減組43只,正常對(duì)照25只。標(biāo)本制備禁食12h,腹腔麻醉,腹主動(dòng)脈取血,留取腦組織、垂體、卵巢組織,其中一部分置凍存管中,立即放入液氮中,冷卻后置-80℃冰箱保存,用于實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。一部分組織使用10%甲醛液中固定,然后經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、連續(xù)切片免疫組織化學(xué)將石蠟包埋的組織標(biāo)本制成3~4um厚度的切片,常規(guī)采用二甲苯脫蠟,梯度酒精脫水。置于微波爐調(diào)到中高火加熱至沸騰,冷卻15min后,再煮沸一次冷卻后即可完成抗原修復(fù)。0.3%的過(guò)氧化氫溶液處理30min以封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶;1%正常兔血清封閉切片1h。滴加一抗(兔抗Gn RH多克隆抗體,)/兔抗TSHR多克隆抗體,加廣譜生物素標(biāo)記的二抗,加鏈霉素一生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物,DAB顯色,蘇木精輕度復(fù)染,中性樹(shù)膠封片。引物設(shè)計(jì)和反應(yīng)條件根據(jù)Genbank序列,使用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)引物,由大連Ta Ka Ra公司合成引物。引物序列見(jiàn)正文。RNA的提取及mRNA的合成按試劑盒說(shuō)明書(shū),使用Trizol(Invitrogen(英杰生命科技有限公司)從組織中提取RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen(英杰生命科技有限公司)合成m RNA。Real-time PCR分析使用Trizol從組織中提取RNA。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟,分別加入引物及i Taq Universal SYBR Green master mix(Tli RNase H Plus)(寶生物工程大連有限公司),使用Applied Biosystems 7500/7500 Fast Real-Time PCR System(Thermo Fisher,Singapore)檢測(cè)m RNA的表達(dá)水平�；虮磉_(dá)量用2~(-ΔΔCt)相對(duì)量表示。目的基因表達(dá)水平以β-actin作為內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,結(jié)果以RQ值等來(lái)體現(xiàn)。ELISA法測(cè)定血清T3 T4 TSH按照藥盒說(shuō)明書(shū)(上海源葉生物技術(shù)有限公司)采用ELISA法測(cè)定T3 T4 TSH。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS16.0軟件進(jìn)行分析,正態(tài)分布計(jì)量資料數(shù)據(jù)以sx±描述,偏態(tài)分布定量數(shù)據(jù)用M(P25,P75)表示,符合正態(tài)分布多組定量數(shù)據(jù)間差異比較采用單因素方差分析(One-way analysis of variance,One-way ANOVA),多組之間兩兩比較采用SNK-Q檢驗(yàn)的方法,P0.05時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義不滿足正態(tài)分布的多組之間的比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn),多組之間兩兩比較采用P值修正的方法。兩組和多組定性數(shù)據(jù)之間的比較采用卡方檢驗(yàn)的方法。結(jié)果:⑴4組間下丘腦GnRH mRNA RQ值:通過(guò)單因素方差分析,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.412,P=0.296)⑵4組間垂體GnRH mRNA RQ值:差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.153,P=0.368)⑶4組間卵巢GnRH mRNA RQ值:差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(c=1.276,P=0.077)⑷4組間下丘腦TSH mRNA RQ值:通過(guò)單因素方差分析,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.658,P=0.596)⑸4組間垂體TSH mRNA RQ值:通過(guò)單因素方差分析,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.305,P=0.318)⑹4組間卵巢TSH mRNA RQ值:通過(guò)單因素方差分析,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.281,P=0.838)⑺正常組下丘腦、垂體、卵巢GnRH mRNA RQ值比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(c2=7.372,P=0.025);卵巢與垂體GnRH mRNA RQ值比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=0.889,P=0.374);卵巢與下丘腦GnRH mRNARQ值比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=2.666,P=0.008);垂體與下丘腦GnRH mRNA RQ值比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=1.778,P=0.075)⑻甲減組下丘腦、垂體、卵巢GnRH mRNA RQ值比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(標(biāo)準(zhǔn)c2=8.769,P=0.012);卵巢與垂體GnRH mRNA RQ值比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=1.177,P=0.239);卵巢與下丘腦GnRH mRNA RQ值比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=2.942,P=0.003);垂體與下丘腦GnRH mRNA RQ值比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=1.765,P=0.078)⑼正常妊娠組下丘腦、垂體、卵巢GnRH mRNA RQ值比較:差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(標(biāo)準(zhǔn)c2=6.144,P=0.046);卵巢與下丘腦GnRH mRNA RQ值比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=2.204,P=0.028);卵巢與垂體GnRH mRNA RQ值比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=2.205,P=0.043);垂體與下丘腦GnRH mRNA RQ值比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=0.329,P=0.742)⑽甲減妊娠組下丘腦、垂體、卵巢GnRH mRNA RQ值比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(標(biāo)準(zhǔn)c2=8.909,P=0.012);卵巢與垂體GnRH mRNA RQ值比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=1.706,P=0.088);卵巢與下丘腦GnRH mRNA RQ值比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=2.961,P=0.003);垂體與下丘腦GnRH mRNA RQ值比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=1.382,P=0.167)⑾正常組下丘腦、垂體、卵巢TSH mRNA RQ值比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=7.276,P=0.013);卵巢與垂體TSH mRNA RQ值比較:通過(guò)單因素方差分析,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.000);卵巢與下丘腦TSH mRNA RQ值比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.030);垂體與下丘腦TSH mRNA RQ值比較:通過(guò)單因素方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.026)⑿甲減組下丘腦、垂體、卵巢TSH mRNA RQ值比較,通過(guò)Kruskal-Wallis檢驗(yàn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(X~2=2.577,P=0.276)⒀正常妊娠組下丘腦、垂體、卵巢TSH mRNA RQ值比較:差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=0.894,P=0.640)⒁甲減妊娠組下丘腦、垂體、卵巢TSH m RNA RQ值比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.907,P=0.210)⒂下丘腦GnRHR表達(dá):ar核團(tuán)在4個(gè)組中,通過(guò)單因素方差分析,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.373,P=0.774);vmh核團(tuán)在4個(gè)組中,通過(guò)單因素方差分析,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.346,P=0.291);ah核團(tuán)在4個(gè)組中,通過(guò)Kruskal-Wallis檢驗(yàn),差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(標(biāo)準(zhǔn)c2=2.486,P=0.478);pa核團(tuán)在4個(gè)組中,通過(guò)單因素方差分析,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.591,P=0.670);pmv核團(tuán)在4個(gè)組中,通過(guò)單因素方差分析,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.517,P=0.676);甲減妊娠組中,通過(guò)單因素方差分析,5個(gè)核團(tuán)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.440,P=0.779);甲減組中,通過(guò)Kruskal-Wallis檢驗(yàn),5個(gè)大腦核團(tuán)之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(標(biāo)準(zhǔn)c2=0.717,P=0.949);正常組中,通過(guò)單因素方差分析,5個(gè)核團(tuán)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.810,P=0.531);正常妊娠組中,通過(guò)單因素方差分析,5個(gè)核團(tuán)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.432,P=0.782)⒃垂體GnRHR表達(dá):通過(guò)Kruskal-Wallis檢驗(yàn),4個(gè)組間積分光密度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0.37);通過(guò)Nemenyi檢驗(yàn),甲減妊娠組與甲減組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(標(biāo)準(zhǔn)X~2=0.089,P=0.929),甲減妊娠組與正常組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(標(biāo)準(zhǔn)X~2=1.809,P=0.071),甲減妊娠組與正常妊娠組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(標(biāo)準(zhǔn)X~2=2.345,P=0.019),甲減組與正常組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(標(biāo)準(zhǔn)X~2=1.720,P=0.086),甲減組與正常妊娠組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(標(biāo)準(zhǔn)X~2=2.268,P=0.023),正常組與正常妊娠組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(標(biāo)準(zhǔn)X~2=0.779,P=0.436)⒄卵巢GnRHR表達(dá):通過(guò)單因素方差分析,4個(gè)組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.544,P=0.655)⒅下丘腦TSHR表達(dá):ar核團(tuán)在4個(gè)組中,通過(guò)單因素方差分析,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.753,P=0.536);vmh核團(tuán)在4個(gè)組中,通過(guò)Kruskal-Wallis檢驗(yàn),差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(標(biāo)準(zhǔn)c2=5.795,P=0.122);ah核團(tuán)在4個(gè)組中,通過(guò)Kruskal-Wallis檢驗(yàn),差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(標(biāo)準(zhǔn)c2=4.953,P=0.175);pa核團(tuán)在4個(gè)組中,通過(guò)單因素方差分析,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.972,P=0.430);pmv核團(tuán)在4個(gè)組中,通過(guò)單因素方差分析,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.100,P=0.378)⒆垂體、卵巢TSHR表達(dá):通過(guò)單因素方差分析,4個(gè)組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.721,P=0.240);卵巢TSHR(光密度);通過(guò)單因素方差分析,4個(gè)組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.608,P=0.199)。⒇正常合籠組與甲減合籠組相比,受孕率未見(jiàn)明顯差異(P0.05);甲減妊娠組與正常妊娠組相比,流產(chǎn)率增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1.GnRHR在妊娠期大鼠下丘腦-垂體-卵巢軸組織中均有表達(dá),表明GnRH在該性腺軸中除了參與卵巢產(chǎn)生的激素對(duì)垂體促性腺激素及下丘腦GnRH分泌的長(zhǎng)反饋和調(diào)節(jié)垂體激素(LH和FSH)與下丘腦激素的短反饋外,下丘腦、垂體、卵巢內(nèi)源性Gn RH可能通過(guò)自分泌和旁分泌方式參與大鼠妊娠期的維持。2.在下丘腦各核團(tuán)中,GnRHR分布無(wú)明顯差異,推測(cè)下丘腦GnRH神經(jīng)元可能對(duì)維持大鼠妊娠不起主導(dǎo)作用。3.甲狀腺功能減退癥對(duì)垂體GnRHR產(chǎn)物分布有影響,而對(duì)卵巢、下丘腦各核團(tuán)中的GnRH免疫陽(yáng)性產(chǎn)物分布無(wú)影響。4.4個(gè)組內(nèi)的下丘腦-垂體-卵巢中GnRH mRNA表達(dá)均有差異。甲狀腺功能減退對(duì)組間的下丘腦-垂體-卵巢中GnRH mRNA表達(dá)無(wú)影響。5.甲狀腺功能減退和妊娠因素對(duì)下丘腦-垂體-卵巢中TSH mRNA表達(dá)未發(fā)現(xiàn)有影響。甲狀腺功能減退癥對(duì)卵巢、下丘腦各核團(tuán)中的TSHR分布無(wú)影響。6.甲狀腺功能減退癥對(duì)大鼠的妊娠產(chǎn)生了不利的影響。目的通過(guò)甲狀腺過(guò)氧化物酶抗體(TPOAb)的測(cè)定,觀察對(duì)甲狀腺功能正常孕早期婦女妊娠的影響。方法293例妊娠早期伴甲狀腺功能正常的婦女作為研究人群,比較抗甲狀腺過(guò)氧化物酶抗體陽(yáng)性、陰性組及干預(yù)組妊娠期婦女甲狀腺功能的改變;比較三組產(chǎn)科并發(fā)癥的發(fā)生率和產(chǎn)后新生兒的臨床特征。結(jié)果本文共研究293例,分析發(fā)現(xiàn)甲狀腺過(guò)氧化物酶抗體陽(yáng)性及陰性組孕婦甲狀腺功能紊亂差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),兩組產(chǎn)科并發(fā)癥之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),陰性組與干預(yù)組產(chǎn)科并發(fā)癥、新生兒臨床特征之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論甲狀腺過(guò)氧化物酶抗體陽(yáng)性妊娠期婦女甲狀腺功能有向亞臨床甲狀腺功能減退發(fā)展的傾向,甲狀腺過(guò)氧化物酶抗體陽(yáng)性與陰性組相比產(chǎn)科并發(fā)癥有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示甲狀腺過(guò)氧化物酶抗體陽(yáng)性對(duì)妊娠產(chǎn)生不好的結(jié)果。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R714.256

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2492841