【摘要】：研究背景子宮內(nèi)膜異位癥(簡(jiǎn)稱內(nèi)異癥)是一種婦科常見的良性疾病,其在生育期女性中的發(fā)病率約為10%-15%；其除了可以引起繼發(fā)性的進(jìn)行性加重的痛經(jīng)或慢性盆腔痛外,還可以引起性交痛和不孕等一系列臨床癥狀。內(nèi)異癥是一種良性疾病,但是其具有異地黏附、種植、侵襲及血管生成等類似惡性腫瘤的生物學(xué)行為。由于內(nèi)異癥的發(fā)病機(jī)制不明確,目前尚缺乏徹底根治內(nèi)異癥的有效方法。因此,深入探討新的基因功能改變與內(nèi)異癥發(fā)生的關(guān)系,從分子水平解釋其發(fā)生的機(jī)制,并設(shè)計(jì)合理的靶向藥物治療對(duì)改善內(nèi)異癥預(yù)后具有重要意義。Periostin屬于Matricellular Proteins家族,該家族蛋白是一種細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)分子,其能夠介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)間相互作用,并且能夠增強(qiáng)細(xì)胞的生存、黏附和侵襲能力。Periostin在結(jié)構(gòu)上包括其N-末端、一個(gè)富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域(EMI)、四個(gè)同源性重復(fù)結(jié)構(gòu)域(FAS)以及其C-末端,其中FAS1結(jié)構(gòu)域中含有整合素的結(jié)合位點(diǎn)。Periostin與整合素結(jié)合后能夠激活整合素通路進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生存、黏附和轉(zhuǎn)移。文獻(xiàn)報(bào)道,Periostin在多種惡性腫瘤中均高度表達(dá),能夠促進(jìn)腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。大黃素是一種廣泛存在于大黃、首烏、虎杖、決明子等植物根莖中的一種蒽醌化合物。大黃素是多種中草藥的主要成分,其具有抗菌、抗炎、抗腫瘤及免疫抑制等多種生物活性。近年來(lái),有關(guān)大黃素在腫瘤治療中的研究指出大黃素在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移中具有重要作用。相關(guān)報(bào)道指出,大黃素通過(guò)激活A(yù)MPKa和ERK1/2信號(hào)通路下調(diào)整合素鏈接激酶(ILK)轉(zhuǎn)錄因子Spl和c-Jun的表達(dá)而下調(diào)ILK的表達(dá)進(jìn)而抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。整合素鏈接激酶(ILK)是一種分子量為59KD的胞漿蛋白,在介導(dǎo)細(xì)胞與ECM及細(xì)胞與細(xì)胞間的黏附中發(fā)揮重要作用,其能夠通過(guò)調(diào)控多種信號(hào)傳導(dǎo)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞的生存、增殖、遷移及侵襲。此外,ILK在功能上具備絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶的活性,可以磷酸化多種下游蛋白,如GSK-3β、Akt、Erkl/2和NF-κB等,參與調(diào)節(jié)多種信號(hào)通路進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的生存、增殖、遷移及侵襲。ILK亦能夠通過(guò)上調(diào)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生EMT。ILK高表達(dá)于多種腫瘤中并與腫瘤轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)；敲除ILK能夠明顯抑制細(xì)胞EMT、遷移和侵襲能力。第一部分Periosin調(diào)控ILK通路促進(jìn)子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞發(fā)生遷移、侵襲的作用及機(jī)制研究研究目的：1.檢測(cè)Periostin在子宮內(nèi)膜異位癥患者在位和異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)；2.探討Periostin對(duì)子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞增殖、黏附、遷移和侵襲能力的影響及其作用機(jī)制。研究方法：采用分離法原代培養(yǎng)人子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞(ESCs),包括對(duì)照組子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞(CSCs)、內(nèi)異癥患者在位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞(EuSCs)和異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞(EcSCs). Real-time PCR和western blot分別檢測(cè)子宮內(nèi)膜異位癥患者在位和異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中Periostin的表達(dá)。Western blot檢測(cè)CSCs、EuSCs和EcSCs中ILK和p-Akt的表達(dá)水平。Transwell試驗(yàn)檢測(cè)CSCs、EuSCs和EcSCs的遷移和侵襲能力。干擾EcSCs中Periostin的表達(dá)后,real-time PCR和western blot分別檢測(cè)siRNA-ILK的干擾效率；western blot檢測(cè)干擾前后EcSCs中 ILK、p-Akt的表達(dá)變化；MTT試驗(yàn)、細(xì)胞黏附試驗(yàn)、transwell試驗(yàn)分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后EcSCs增殖、黏附、遷移和侵襲能力的改變。研究結(jié)果：1.ESCs的鑒定及純度檢測(cè)：成功分離并培養(yǎng)人ESCs,且細(xì)胞的純度為96.5%±2.5%。2. Periostin、ILK和p-AKT在ESCs中的表達(dá)：EuSCs口EcSCs較CSCs中Periostin的mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯升高,且EcSCs中表達(dá)水平最高(蛋白水平：EuSCs vs CSCs P0.05, EcSCs vs CSCs P 0.001; mRNA水平：EuSCs vs CSCs P 0.05, EcSCs vs CSCs P 0.05);增殖期內(nèi)膜較分泌期內(nèi)膜中Periostin的蛋白表達(dá)水平稍高,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。此外,EuSCs和EcSCs較CSC s中ILK口p-Akt的表達(dá)在蛋白水平上明顯升高(P 0.05), EuSCs和EcSCs中表達(dá)無(wú)明顯差異(P0.05)3. Periostin對(duì)ESCs中ILK和p-AKT表達(dá)的影響：siRNA-Periostin轉(zhuǎn)染后,EcSCs中Periostin的表達(dá)水平明顯下降(P 0.05), EcSCs中ILK和p-Akt的表達(dá)水平亦明顯下降(P0.05)。4. Periostin對(duì)ESCs增殖和黏附能力的影響：雖然EuSCs和EcSCs的增殖能力較CSCs稍強(qiáng),但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 0.05); siRNA-Periostin轉(zhuǎn)染下調(diào)EcSCs中Periostin表達(dá)后,EcSCs的增殖能力無(wú)明顯變化(P 0.05)。EcSCs的黏附能力較EuSCs和CSCs明顯升高(P0.05)；EuSCs和CSCs的黏附能力無(wú)明顯差異(P0.05)。siRNA-Periostin轉(zhuǎn)染下調(diào)EcSCs中Periostin表達(dá)后,EcSCs的黏附能力明顯下降(P0.05)。5. Periostin對(duì)ESCs遷移和侵襲能力的影響：EuSCs和EcSCs的遷移和侵襲能力較CSCs明顯增高(遷移能力：P0.01；侵襲能力：P0.001)；其中EcSCs的遷移和侵襲能力最強(qiáng)。siRNA-Periostin轉(zhuǎn)染下調(diào)EcSCs中Periostin表達(dá)后,EcSCs的遷移和侵襲能力明顯下降(遷移能力：P0.05；侵襲能力：P0.01)研究結(jié)論：1. Periostin能夠明顯增強(qiáng)子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的黏附、遷移和侵襲能力,對(duì)細(xì)胞的增殖能力無(wú)明顯影響。2. Periostin通過(guò)調(diào)控ILK通路增強(qiáng)子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的黏附、遷移和侵襲能力進(jìn)而促進(jìn)內(nèi)異癥的發(fā)生發(fā)展。第二部分Periosin調(diào)控ILK通路誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用及機(jī)制研究研究目的：1.檢測(cè)Periostin對(duì)子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響；2.探討Periostin誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的作用及機(jī)制。研究方法：采用分離法原代培養(yǎng)人子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞(EECs); transwell細(xì)胞遷移和侵襲試驗(yàn)檢測(cè)不同濃度Periostin作用前后細(xì)胞遷移和侵襲能力的改變;western blot檢測(cè)不同濃度Periostin作用前后細(xì)胞中E-cadherin、keratin、N-cadherin、 vimentib、ILK、p-Akt、Slug和Zebl的表達(dá)變化；siRNA干擾EECs中ILK的表達(dá),western blot檢測(cè)干擾前后細(xì)胞中ILK、E-cadherin、keratin、N-cadherin、 vimentin、p-Akt、Slug和Zebl的表達(dá); Perios tin作用于siRNA-ILK干擾后的EECs,檢測(cè)作用前后細(xì)胞中上述相關(guān)指標(biāo)的變化。研究結(jié)果：1.EECs的鑒定及純度檢測(cè)：成功分離并培養(yǎng)人EECs,且細(xì)胞的純度為95.6%±3.5%。2. Periostin對(duì)EECs遷移和侵襲能力的影響：Periostin (20ng/ml和40ng/ml)作用于EECs 48小時(shí)后,細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯增強(qiáng)(遷移能力：2Ong/ml P 0.01,40ng/ml P0.001;侵襲能力：20ng/ml P0.05,40ng/ml P0.01).3. Periostin對(duì)EECs中EMT相關(guān)蛋白、ILK及p-Akt表達(dá)的影響：Periostin作用于EECs 48小時(shí)后,E-cadherin和keratin表達(dá)下調(diào),而N-cadherin和vimentin表達(dá)上調(diào)；且Periostin 40ng/ml組結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。此外,Periostin作用后,EECs內(nèi)ILK、p-Akt、slug和Zebl的表達(dá)水平均升高；且Periostin 40ng/ml組結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4.干擾EECs中ILK表達(dá)后細(xì)胞中ILK, p-Akt及EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的變化：轉(zhuǎn)染siRNA-ILK干擾細(xì)胞中ILK的表達(dá)后,EECs中p-Akt、slug和Zebl的表達(dá)水平均明顯下降(P0.05)；細(xì)胞中上皮表型標(biāo)志性分子E-cadherin和keratin表達(dá)上調(diào)(P0.05),間質(zhì)表型標(biāo)志性分子N-cadherin和vimentin表達(dá)下調(diào)(P0.01)。Periostin (40ng/ml)能夠明顯減弱上述ILK干擾所引起的變化；但是,與對(duì)照組或空載轉(zhuǎn)染組相比,siRNA-ILK轉(zhuǎn)染+Periostin作用組EECs中p-Akt、slug、Zebl以及EMT標(biāo)志性分子的表達(dá)水平無(wú)明顯改變(P0.05)。表明：ILK干擾后,Periostin失去上調(diào)p-Akt、slug和Zebl表達(dá)以及誘導(dǎo)EECs發(fā)生EMT的能力。研究結(jié)論：1. Periostin能夠增強(qiáng)子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞的遷移和侵襲能力。2. Periostin能夠誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞發(fā)生EMT。3. Periostin通過(guò)激活I(lǐng)LK通路誘導(dǎo)EECs發(fā)生EMT。第三部分大黃素調(diào)控ILK通路誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞發(fā)生間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化在抑制細(xì)胞遷移和侵襲能力中的作用及機(jī)制研究研究目的：1.檢測(cè)子宮內(nèi)膜異位癥患者在位和異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中ILK的表達(dá)及細(xì)胞的遷移和侵襲能力；2.探討大黃素對(duì)子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響；3.探討大黃素誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞發(fā)生間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化(MET)的作用及機(jī)制。研究方法：采用分離法原代培養(yǎng)人子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞(ESCs),包括對(duì)照組子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞(CSCs)、內(nèi)異癥患者在位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞(EuSCs)和異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞(EcSCs).Western blot分別檢測(cè)CSCs.EuSCs和EcSCs中ILK的表達(dá)水平。Transwell試驗(yàn)分別檢測(cè)CSCs.EuSCs和EcSCs的遷移和侵襲能力。濃度梯度大黃素作用于EcSCs后,MTT試驗(yàn)和transwell試驗(yàn)分別檢測(cè)作用前后細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的改變。濃度梯度大黃素作用于EcSCs后,western blot檢測(cè)作用前后細(xì)胞中E-cadherin、keratin.N-cadherin和vimentin的變化。siRNA轉(zhuǎn)染干擾EcSCs中ILK的表達(dá),質(zhì)粒轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)CSCs中ILK的表達(dá)；western blot分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后EcSCs和CSCs中ILK.E-cadherin.keratin.N-cadherin和 vimentin的表達(dá)；transwell試驗(yàn)分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后EcSCs和CSCs遷移和侵襲能力的改變。大黃素作用于轉(zhuǎn)染前后的ESCs,檢測(cè)作用前后細(xì)胞中上述指標(biāo)的變化。研究結(jié)果：1.ESCs中ILK的表達(dá)及細(xì)胞遷移和侵襲能力的檢測(cè)：EuSCs和EcSCs中ILK的表達(dá)水平較CSCs中明顯上調(diào),其中,EcSCs中ILK的表達(dá)水平最高(EuSCs vs CSCs:P0.01:EcSCs vs CSCs:P0.001).細(xì)胞形態(tài)方面,與CSCs相比,EuSCs和EcSC s在形態(tài)上更加細(xì)長(zhǎng),更趨近于梭形細(xì)胞。EuSCs和EcSCs的遷移和侵襲能力均較CSCs顯著增強(qiáng)；其中,EcSCs的遷移和侵襲能力最強(qiáng)(遷移能力：P0.01；侵襲能力：EuSCs vs CSCs P0.05,EcSCs vs CSCs P0.01).2.大黃素對(duì)ESCs增殖、遷移和侵襲能力的影響：大黃素對(duì)EuSCs和EcSCs增殖能力的抑制呈時(shí)間和濃度依賴性(P0.05)。大黃素作用于EcSCs,細(xì)胞體積變小,由長(zhǎng)梭形變成較規(guī)則的多邊形；此外,大黃素能夠明顯降低EcSCs的遷移和侵襲能力(遷移能力：20μP0.05,40μMP0.01；侵襲能力：20μMP0.05,40μMP0.01)。3.大黃素作用于EcSCs后細(xì)胞內(nèi)ILK及MET相關(guān)蛋白的表達(dá)變化：濃度梯度大黃素作用于EcSCs 48h,隨大黃素濃度的增加細(xì)胞中ILK、間質(zhì)表型N-cadherin和vimentin的表達(dá)水平明顯降低(P0.05),而上皮表型E-cadherin 和keratin表達(dá)明顯升高(P0.05).40μM大黃素作用于E cSCs,隨大黃素作用時(shí)間的增加細(xì)胞中ILK、間質(zhì)表型N-cadherin和vimentin的表達(dá)水平明顯降低(P0.05),而上皮表型E-cadherin和keratin表達(dá)明顯升高(P0.05)。4.干擾EcSCs中ILK表達(dá)后細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)及細(xì)胞遷移和侵襲能力的改變：研究顯示ILK在EcSCs中表達(dá)水平最高,因此選用ILK siRNA干擾下調(diào)EcSCs中ILK的表達(dá)。與N.C.組相比,ILK siRNA組ILK、間質(zhì)表型N-cadherin和vimentin的表達(dá)水平明顯下調(diào)(P0.001),而上皮表型E-cadherin和keratin的表達(dá)水平明顯上調(diào)(P0.001)。此外,與N.C.組相比,ILK siRNA組細(xì)胞的遷徙和侵襲能力明顯下降(遷移能力P0.01,侵襲能力P0.001)。大黃素能夠強(qiáng)化ILKsiRNA干擾所引起的上述細(xì)胞分子及功能改變(P0.05)。5.質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CSCs過(guò)表達(dá)ILK后細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)及細(xì)胞遷移和侵襲能力的改變：研究顯示CSCs中ILK的表達(dá)水平最低,因此選用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)CSCs中ILK的表達(dá)。與pEGFP-C1空載體組相比,pEGFP-C1-ILK組細(xì)胞中ILK、間質(zhì)表型N-cadherin和vimentin的表達(dá)水平明顯升高(P0.05),而上皮表型E-cadherin和keratin的表達(dá)水平明顯降低(P0.05)。此外,與pEGFP-C1空載體組相比,pEGFP-C1-ILK組細(xì)胞的遷徙和侵襲能力明顯增強(qiáng)(遷移能力P0.01,侵襲能力P0.001)。雖然大黃素能夠減弱上述各作用(P0.05)；但是,與無(wú)大黃素作用的pEGFP-C1空載體轉(zhuǎn)染CSCs組相比,過(guò)表達(dá)ILK后大黃素失去了誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生MET及抑制細(xì)胞遷移和侵襲的能力(P0.05)。研究結(jié)論：1.大黃素能夠以時(shí)間及濃度依賴性抑制子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。2.大黃素能夠誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞發(fā)生MET抑制細(xì)胞發(fā)生遷移和侵襲。3.大黃素通過(guò)調(diào)控ILK通路誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞發(fā)生MET進(jìn)而抑制細(xì)胞的遷移和侵襲能力。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R711.71
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本文編號(hào)：2480915