【摘要】：目的：卵巢癌為婦科生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，其發(fā)病率位居第三位，而病死率卻高居?jì)D科腫瘤之首。卵巢癌早期常無癥狀，發(fā)現(xiàn)時(shí)多為晚期，極易發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，預(yù)后極差，嚴(yán)重威脅廣大婦女的生命及健康。手術(shù)和化療是治療卵巢癌的主要方法，而化療耐藥是其預(yù)后差的重要原因之一，因此尋找卵巢癌治療的新型藥物及新型靶點(diǎn)已成為迫切需要。 染料木黃酮(Genistein)又稱染料木素、金雀異黃素，其化學(xué)名為4，5，7-三羥基異黃酮，是一種弱植物雌激素，來源于豆科植物的天然異黃酮類化合物。國內(nèi)外研究表明，Genistein在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展階段存在著多重抑制效應(yīng)，具有多種生物活性，如雌激素樣作用、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)信號(hào)通路等作用，對(duì)多種腫瘤具有較強(qiáng)的抑制作用。其中對(duì)乳腺癌、前列腺癌、肺癌、大腸癌、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤等研究較多，對(duì)卵巢癌的體內(nèi)研究有限，本實(shí)驗(yàn)以人卵巢漿液性乳頭狀囊腺癌SKOV-3細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤為研究對(duì)象，探討Genistein對(duì)人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤的抑制作用及其對(duì)let-7a靶向抑制高轉(zhuǎn)移率組蛋白HMGA2蛋白的表達(dá)的影響，為Genistein在卵巢癌的臨床應(yīng)用及其進(jìn)一步開發(fā)提供理論依據(jù)。 方法： 1細(xì)胞培養(yǎng)及制備細(xì)胞懸液：人卵巢漿液性乳頭狀囊腺癌SKOV-3細(xì)胞系用RPMI-1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，青霉素100U/L，鏈霉素100u/L，PH7.4），于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。常規(guī)培養(yǎng)的SKOV-3細(xì)胞，待細(xì)胞緊貼培養(yǎng)瓶壁生長，取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，0.25%胰酶消化，10%胎牛血清終止消化，待細(xì)胞充分分散后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，置離心管中2000r/min（r=8cm）離心5min，棄上清，加入無血清的1640培養(yǎng)液吹勻，再次離心，棄上清，用無血清的1640培養(yǎng)液制成2.5×107個(gè)／ml單細(xì)胞的懸液。 2建立裸鼠的卵巢癌皮下移植瘤模型及對(duì)裸鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組：4～6周齡的BALB/C雌性裸鼠于SPF級(jí)環(huán)境下飼養(yǎng)。在無菌條件下，用1ml注射器以每只裸鼠0.2ml細(xì)胞懸液（含有5×106個(gè)細(xì)胞）接種于裸鼠的背側(cè)近前肢處的皮下，于種瘤第7天選擇生長出移植瘤且直徑達(dá)3～6mm的裸鼠入組實(shí)驗(yàn)，未見移植瘤生長的裸鼠淘汰實(shí)驗(yàn)，符合標(biāo)準(zhǔn)的荷瘤裸鼠隨機(jī)分成6組:（1）輔料對(duì)照組6只（羥丙基β環(huán)糊精溶液），（2）低劑量Genistein組6只（50mg/kg/天），（3）中劑量Genistein組6只（150mg/kg/天），（4）高劑量Genistein組6只（450mg/kg/天），（5）順鉑組6只（3mg/kg/天），（6）低劑量Genistein＋順鉑聯(lián)合用藥組6只（劑量同單純用藥）。 3實(shí)驗(yàn)藥物的制備：Genistein工作液即由0.9%氯化鈉注射液配制成的包合物（含4%Genistein，96%羥丙基β環(huán)糊精）溶液，輔料對(duì)照組工作液由0.9%氯化鈉注射液配制成羥丙基β環(huán)糊精溶液。工作液均在無菌條件下濾器過濾后，即刻使用。順鉑注射液用0.9%氯化鈉注射液稀釋成3mg/ml濃度，立刻使用。 4給藥方法： Genistein低中高劑量組分別按50mg/kg/day，150mg/kg/day，450mg/kg/day，腹腔注射，連用21天。順鉑組按3mg/kg/day腹腔注射，連續(xù)7天。聯(lián)合用藥組Genistein按50mg/kg/day腹腔注射，順鉑注射液按3mg/kg/day腹腔注射（用藥時(shí)間同單獨(dú)用藥組）。對(duì)照組每天腹腔注射相同體積羥丙基β環(huán)糊精溶液，連用21天。 5裸鼠重量及移植瘤體積和重量的測(cè)量：每天觀察裸鼠精神生長精神狀態(tài)、飲食、活動(dòng)及大便及移植瘤的生長等情況，給藥第1天開始，每周測(cè)量一次裸鼠體重，游標(biāo)卡尺測(cè)量一次移植瘤的大小，即最長徑（a）和最短徑（b）。停藥24小時(shí)停止觀察，脫頸法處死裸鼠，無菌條件下摘取裸鼠移植瘤組織稱重，按公式V （mm3）=πab2/6計(jì)算移植瘤體積，按公式IR（%）=（1－治療組腫瘤平均重量/對(duì)照組腫瘤平均重量）×100%計(jì)算腫瘤抑瘤率。 6免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)移植瘤組織中高轉(zhuǎn)移率組蛋白HMGA2蛋白的表達(dá)：用4%多聚甲醛固定的移植瘤組織小塊（小于0.5×0.5×0.1cm3）進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，研究移植瘤組織中高轉(zhuǎn)移率組蛋白HMGA2的表達(dá)。 7用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)移植瘤組織中l(wèi)et-7a的表達(dá)：取保存于-80℃冰箱的移植瘤組織，用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)移植瘤組織中l(wèi)et-7a的表達(dá)。 8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。以x±S表示，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多個(gè)樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析檢驗(yàn)結(jié)果，析因設(shè)計(jì)資料的方差分析和秩轉(zhuǎn)換后多個(gè)獨(dú)立樣本的方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1實(shí)驗(yàn)過程順利，僅順鉑組裸鼠給藥結(jié)束后出現(xiàn)輕微精神萎靡、飲食可、活動(dòng)輕微遲緩、大便正常，未見明顯消瘦見其他明顯的不適反應(yīng)。其余實(shí)驗(yàn)組未見不良反應(yīng)，隨著實(shí)驗(yàn)進(jìn)程的發(fā)展，裸鼠周齡增加，實(shí)驗(yàn)組裸鼠的體重均有所增長。順鉑組的裸鼠體重小于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Genistein組裸鼠體重均大于對(duì)照組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。聯(lián)合用藥組的裸鼠體重小于順鉑組和低劑量Genistein組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2Genistein組的移植瘤體積和重量均小于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，，且隨著劑量的增加Genistein抑制作用更加明顯。聯(lián)合用藥組的移植瘤體積和重量小于順鉑組和低劑量Genistein組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3各給藥組移植瘤組織HMGA2的表達(dá)低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4Genistein組中l(wèi)et-7a表達(dá)均大于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，低、中、高劑量Genistein組的let-7a表達(dá)依次增加，兩兩之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。聯(lián)合用藥組的移植瘤let-7a表達(dá)大于對(duì)照組及低劑量Genistein組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論： 1Genistein是一種無明顯毒副反應(yīng)的天然物質(zhì)，可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長，且具有劑量依賴性，與順鉑聯(lián)合應(yīng)用能增強(qiáng)抗腫瘤的效果。 2Genistein組中HMGA2表達(dá)低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，順鉑組中HMGA2表達(dá)低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明順鉑和Genistein可能通過抑制HMGA2的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤的生長。 3各給藥組let-7的表達(dá)均高于對(duì)照組，表明順鉑和Genistein均可以促進(jìn)let-7a的表達(dá)，且兩者有明顯的協(xié)同作用，順鉑和Genistein可能是通過促進(jìn)let-7a的表達(dá)來發(fā)揮抑瘤作用，并且兩者聯(lián)合應(yīng)用有明顯的協(xié)同作用。
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【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R737.31

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2469159