【摘要】：目的：卵巢表面上皮細(xì)胞(Ovarian Surface Epithelial Cell, OSEC)是包被卵巢表面的單層立方-長方形上皮細(xì)胞。由于卵巢定期排卵的生理功能，需要上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)的正常生物學(xué)特性參與卵巢表面上皮的修復(fù)。而且近年的研究發(fā)現(xiàn)，在卵巢表面以及與輸卵管交接的卵巢門區(qū)域也存在成體干細(xì)胞/腫瘤干細(xì)胞(Stem cell, SC/Cancer Stem Cell, CSC)，，參與卵巢表面上皮的生理性修復(fù)。目前認(rèn)為90%的卵巢癌起源于OSEC。因此，本研究提出“EMT和干細(xì)胞/腫瘤干細(xì)胞特性獲得可能參與卵巢表面上皮細(xì)胞的自發(fā)惡性轉(zhuǎn)化”這一科學(xué)假說，通過小鼠卵巢表面上皮細(xì)胞(Mouse Ovarian SurfaceEpithelial Cell, MOSEC)自發(fā)性惡性轉(zhuǎn)化模型的建立，觀察EMT及干細(xì)胞/腫瘤干細(xì)胞特性在MOSEC惡性轉(zhuǎn)化過程中的改變，研究MOSEC自發(fā)惡性轉(zhuǎn)化的可能機(jī)制，初步探究OSEC起源的上皮性卵巢癌發(fā)生早期相關(guān)分子事件，為上皮性卵巢癌的防治提供基礎(chǔ)研究資料。 方法：本研究分為三個(gè)部分。(1) MOSEC自發(fā)性惡性轉(zhuǎn)化模型的建立：分離未生育過的雌性BALB/C小鼠的卵巢表面上皮細(xì)胞，以上皮細(xì)胞標(biāo)志物Pan-keratin鑒定MOSEC的純度。在MOSEC體外連續(xù)傳代培養(yǎng)過程中，使用生長曲線、平板克隆形成及軟瓊脂克隆形成等實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，結(jié)合惡性轉(zhuǎn)化灶出現(xiàn)的細(xì)胞形態(tài)和染色體數(shù)目的變化，分析MOSEC的體外惡性轉(zhuǎn)化能力，通過裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)證實(shí)MOSEC發(fā)生自發(fā)惡性轉(zhuǎn)化。(2) MOSEC自發(fā)惡性轉(zhuǎn)化過程中EMT的作用：使用RT2Profiler PCR Array Mouse EMT試劑盒檢測(cè)EMT相關(guān)基因在不同階段MOSEC表達(dá)水平的變化，以E-cadherin和Pan-keratin為上皮細(xì)胞標(biāo)志物，Vimentin、Snail、Slug及β-catenin為間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物，采用免疫熒光方法定性定位，以及Western Blotting定量分析MOSEC惡性轉(zhuǎn)化不同時(shí)期EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平的變化。(3) MOSEC自發(fā)惡性轉(zhuǎn)化過程中腫瘤干細(xì)胞樣特性的變化：以CD44、CD117、CD133、Nanog及Oct-4為干細(xì)胞/腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物，采用免疫熒光方法定性定位分析惡性轉(zhuǎn)化不同時(shí)期上述標(biāo)志物的變化，流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)CD44+/CD117+細(xì)胞在惡性轉(zhuǎn)化不同時(shí)期的變化；通過懸浮球細(xì)胞形成實(shí)驗(yàn)及限制稀釋實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各階段MOSEC的自我更新能力；使用無mEGF和mbFGF生長因子，但是含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)懸浮球細(xì)胞，觀察其分化能力；最后觀察懸浮球細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的致瘤能力。 結(jié)果： (1) MOSEC自發(fā)性惡性轉(zhuǎn)化模型的建立：根據(jù)細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞增殖能力和染色體數(shù)目的變化，把體外連續(xù)傳代培養(yǎng)的MOSEC分為早期(MOSEC in Early,M-E, P4-P15)、中期(MOSEC in Intermediate, M-I, P20-P85)和晚期(MOSEC inLate, M-L,P90)三個(gè)階段。本實(shí)驗(yàn)分離的MOSEC純度達(dá)90%以上，并且可以在體外長期連續(xù)傳代培養(yǎng)，其中，早期的P10-P15為“艱難期”。隨著細(xì)胞傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞形態(tài)由“經(jīng)典鵝卵石形”變?yōu)椤凹忓N梭形”，克隆形態(tài)由“閉合島形”到“半閉合島形”最后呈“開放島形”，說明MOSEC細(xì)胞連接減弱，運(yùn)動(dòng)能力提高。晚期MOSEC出現(xiàn)惡性轉(zhuǎn)化灶。生長曲線的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，傳代次數(shù)大于40代的中期和晚期MOSEC增殖速度明顯加快，尤其是晚期MOSEC生長曲線更加陡峭。早期、中期和晚期MOSEC的平板克隆形成率分別為0、3.83%(P0.01)及36.00%(P0.01)；軟瓊脂克隆形成率分別為0%、0.02%及1.35%(P0.05)；平均染色體數(shù)目分別為49、58及64，晚期MOSEC超四倍體細(xì)胞比例增高；裸鼠成瘤率分別為0、0及80%。以上細(xì)胞形態(tài)變化、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、染色體數(shù)目分析和裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明，隨著細(xì)胞體外傳代次數(shù)的增加，小鼠卵巢表面上皮細(xì)胞的增殖能力逐漸增強(qiáng)，至晚期發(fā)生了明顯地自發(fā)性惡性轉(zhuǎn)化。 (2) MOSEC自發(fā)惡性轉(zhuǎn)化過程中EMT的作用：體外長期連續(xù)培養(yǎng)過程中，MOSEC由上皮細(xì)胞的“鵝卵石形”轉(zhuǎn)化成間質(zhì)細(xì)胞樣的“紡錘梭形”，并且上皮細(xì)胞標(biāo)志物Pan-keratin及間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Vimentin持續(xù)表達(dá)，說明MOSEC是一種既表達(dá)上皮細(xì)胞標(biāo)志物又表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的“雙性細(xì)胞”；PCR Array的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在MOSEC惡性轉(zhuǎn)化過程中，促進(jìn)EMT過程的Cav2、Cald1、Wnt11和Snail等基因表達(dá)水平增加，而EMT過程中下調(diào)的基因Krt19和Tspan13的表達(dá)也相應(yīng)減少；免疫熒光和Western Blotting的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著細(xì)胞傳代次數(shù)的增加，Snail和Slug表達(dá)量也提高，至晚期達(dá)最高，E-cadherin和β-catenin在中期表達(dá)水平最高，晚期MOSEC中β-catenin表達(dá)略有下調(diào)，但仍高于早期階段。說明MOSEC自發(fā)惡性轉(zhuǎn)化過程伴隨著EMT，并且促進(jìn)EMT過程的轉(zhuǎn)錄因子Snail和Slug表達(dá)量與MOSEC的惡性轉(zhuǎn)化程度一致； (3) MOSEC自發(fā)惡性轉(zhuǎn)化過程中腫瘤干細(xì)胞樣特性的變化：干細(xì)胞/腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD44、CD117、CD133及Oct-4在早期MOSEC中就表達(dá)，隨著細(xì)胞傳代次數(shù)增加，CD44和CD117陽性表達(dá)率逐漸提高，Nanog陽性表達(dá)也出現(xiàn)；早期、中期和晚期MOSEC懸浮球形細(xì)胞形成率分別為0%、0.14%和0.69%(P0.05)，并且發(fā)現(xiàn)第五代懸浮球形細(xì)胞的懸浮球形成率明顯高于晚期MOSEC(P0.01)。限制稀釋實(shí)驗(yàn)提示晚期MOSEC需要96.30個(gè)細(xì)胞可形成一個(gè)腫瘤細(xì)胞球；晚期MOSEC形成的懸浮細(xì)胞球在血清誘導(dǎo)下可以貼壁生長，提示其具有干細(xì)胞特性即分化能力；與晚期MOSEC相比，其形成的懸浮球細(xì)胞接種于裸鼠后提前2周出現(xiàn)腫塊，并且發(fā)現(xiàn)懸浮球細(xì)胞形成的腫瘤組織CD44陽性細(xì)胞數(shù)也明顯多于晚期MOSEC。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，早期MOSEC即存在干細(xì)胞/腫瘤干細(xì)胞，隨著MOSEC體外傳代次數(shù)的增加，干細(xì)胞樣細(xì)胞比例增加，MOSEC自我更新能力增強(qiáng)，在血清的誘導(dǎo)下也具有分化能力，說明干細(xì)胞/腫瘤干細(xì)胞特性的獲得參與了MOSEC自發(fā)惡性轉(zhuǎn)化的過程。 結(jié)論： 1.本實(shí)驗(yàn)分離的小鼠卵巢表面上皮細(xì)胞純度達(dá)90%以上，并且在體外長期連續(xù)培養(yǎng)的過程中，可以自發(fā)性惡性轉(zhuǎn)化； 2. EMT參與小鼠卵巢表面上皮細(xì)胞的自發(fā)性惡性轉(zhuǎn)化過程，這與它是一種既表達(dá)上皮細(xì)胞標(biāo)志物又表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的“雙性細(xì)胞”有關(guān)，并且促進(jìn)EMT過程的轉(zhuǎn)錄因子Snail和Slug表達(dá)量與小鼠卵巢表面上皮細(xì)胞的自發(fā)性惡性轉(zhuǎn)化的程度一致； 3.干細(xì)胞/腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞特性獲得參與小鼠卵巢表面上皮細(xì)胞的自發(fā)性惡性轉(zhuǎn)化過程，這與它早期即表達(dá)CD44、CD117、CD133和Oct-4等干細(xì)胞/腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物有關(guān)，并且干細(xì)胞樣細(xì)胞比例增加和自我更新能力增強(qiáng)與小鼠卵巢表面上皮細(xì)胞自發(fā)性惡性轉(zhuǎn)化程度一致。
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【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R737.31

【參考文獻(xiàn)】

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1 胡琢瑛;林曉;;Wnt-1、beta-catenin及C-myc在上皮性卵巢癌中的表達(dá)及意義[J];中國婦幼保健;2009年05期

本文編號(hào)：2468547