【摘要】：日益增高的不孕不育發(fā)生率對人類的健康和生存構(gòu)成了嚴重威脅。臨床上，不孕癥和胚胎早期自然流產(chǎn)、人工助孕不明原因的失敗、胎兒遺傳疾病及育齡婦女多囊卵巢綜合征等生殖方面疾病逐年增多，已成為困擾人們身心健康的世界性問題，也是當今生命科學研究的熱點問題。除了生殖功能后天的損傷和污染的影響，胚胎獲得性缺陷也占一個很高的比例。有些數(shù)據(jù)表明，這些病因未明的胚胎獲得性缺陷與性腺發(fā)育異常及相關(guān)基因的缺陷有關(guān)。生殖細胞是性腺的重要組成部分，它們的形成和擴增在性腺發(fā)育中起決定作用，進而影響繁衍生殖的功能。 人類原始生殖細胞（primordial germ cells, PGCs）是包括卵子和精子在內(nèi)的各型生殖細胞的共同起源細胞（祖細胞），PGCs與生殖發(fā)育密切相關(guān)，在人類的生存和發(fā)展進程中發(fā)揮重要作用。在妊娠期2-3周，人類早期胚胎開始出現(xiàn)PGCs，定位在胚胎的尿囊和間質(zhì)的上胚層。到妊娠期的5-6周，PGCs遷徙到原始生殖嵴。遷移后的PGCs經(jīng)過一系列的擴增與初始分化，形成約5-7百萬個卵原或精原細胞，這些原始細胞被支持細胞和體細胞圍繞，共同組成早期性腺。PGCs的成熟過程呈階段性發(fā)展并被精密地調(diào)控著。本實驗主要就遷移后的原始生殖細胞進行研究，這個時期是細胞的增殖和性別分化的決定時期，是由細胞內(nèi)外因素共同調(diào)控的。通過體外誘導胚胎干細胞分化為生殖干細胞，科學家們發(fā)現(xiàn)主要的外部因素骨成形素蛋白(Bone Morphogenetic Protein，BMP)。而內(nèi)在因素是一系列內(nèi)源性機制調(diào)控不同基因，按照特定的時間和空間嚴格表達，以確保原始生殖細胞生成的正常活動。內(nèi)源性機制主要包括四個方面：RNA結(jié)合蛋白（RNA-binding Protein，RBP）調(diào)控，轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控、全能性基因調(diào)控和表觀遺傳調(diào)控。本實驗選擇RNA結(jié)合蛋白LIN28及標記蛋白OCT4進行研究。 LIN28是一種高度保守的RNA結(jié)合蛋白，是生殖細胞增殖和分化過程中必不可少的因子，并與人類睪丸生殖細胞腫瘤的發(fā)生與惡變密切相關(guān)。通過對小鼠的研究，發(fā)現(xiàn)LIN28高度表達在小鼠胚胎干細胞和早期胚胎發(fā)育過程。體外誘導實驗發(fā)現(xiàn)，LIN28在人胚胎干細胞中高度表達，并且可以提高誘導多能干細胞向生殖干細胞的轉(zhuǎn)化效率。而八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4（Octamer-bindingTranscription Factor4，OCT4），一個著名的早期生殖細胞標記物，在維持胚胎干細胞的多能性和自我更新方面起關(guān)鍵作用。因其在孕早期性腺中特異地高表達，OCT4常用于目前生殖領(lǐng)域的研究標記。然而目前為止，還沒有發(fā)現(xiàn)其他穩(wěn)定的指標為判斷胎兒生殖細胞的不同發(fā)育階段提供依據(jù)。為此，我們選擇多能性標記物LIN28與OCT4相比較。尋找適用于生殖細胞發(fā)育的不同階段正確的標記物，從而揭示人類生殖細胞的發(fā)生、發(fā)育、成熟及受精的調(diào)節(jié)機制是診斷和治療不孕不育癥和提高優(yōu)生優(yōu)育的基礎(chǔ)和關(guān)鍵，也將為當今治療不孕癥的主要手段——輔助生育技術(shù)提供重要理論依據(jù)，并有助于創(chuàng)立新的避孕措施。 目的 本課題通過對男胎早期性腺組織中生殖細胞特異性因子的檢測，分析LIN28和OCT4在原始生殖細胞的表達變化趨勢，探索OCT4和LIN28蛋白在胎兒發(fā)育初期過程中的表達功能和作用機制。實驗目的：為進一步研究PGCs的形成及增殖，理解生殖細胞和早期胎兒發(fā)育。以探討不孕不育、胎兒發(fā)育及遺傳缺陷主要成因，為不孕、胚胎移植失敗、流產(chǎn)和遺傳病的診斷和防治提供理論依據(jù)。 材料與方法 收集棄之不用的6 20周的多胎妊娠減胎標本、流產(chǎn)和引產(chǎn)標本的人類胎兒睪丸組織共20例，進行快速冰凍切片和免疫組織化學熒光染色測定組織LIN28和OCT4。使用激光共聚焦顯微鏡拍照并統(tǒng)計LIN28和OCT4陽性細胞。將標本按胎齡（7周、8周、9周、10周、11-12周、13-14周）分為6組（未發(fā)現(xiàn)兩種因子的6周減胎標本和只有LIN28單因子表達的20周引產(chǎn)組織不納入其中），每組n=3，分別統(tǒng)計不同時期兩種因子的表達變化及趨勢。實驗數(shù)據(jù)以x s形式來表示。定量資料符合正態(tài)分布和方差齊性的采用one-wayANOVA分析。應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理。以α=0.05為檢驗水準。 結(jié)果 1．LIN28在胎兒睪丸發(fā)育7-20周的PGCs中高度表達 胎兒睪丸組織的免疫組化熒光染色顯示了妊娠7-14孕周胎兒睪丸組織中存在LIN28和OCT4蛋白的高度表達。研究發(fā)現(xiàn)這些OCT4-標記的陽性細胞在形態(tài)學上具有生殖母細胞的典型特征：圓形、規(guī)則細胞核，較高的核質(zhì)比。將這些陽性細胞認定為PGCs。 2．LIN28和OCT4相對表達水平的變化 隨著胎兒睪丸發(fā)育的關(guān)鍵時期，LIN28的表達量逐漸增高，而在胎齡11周后，，早期標記蛋白OCT4陽性細胞就不斷減少，到胎齡13周時，已經(jīng)很少被觀測到。在胎齡20周的睪丸組織中，只有LIN28的表達可以在免疫組化結(jié)果中觀測到。 3．LIN28在PGCs中表達的亞細胞定位變化 標記蛋白OCT4在早期胚胎發(fā)育過程中的表達一直定位在PGCs的細胞核中。而對于LIN28，定位是變化的。在胎齡第7周，同樣表達在PGCs的胞核內(nèi)。在第8-9周，開始檢測到生殖細胞胞核和胞質(zhì)中均表達LIN28，而10周后，出現(xiàn)部分只在胞質(zhì)中的陽性細胞。最后，妊娠第11-13周及20周，基本所有的LIN28陽性細胞都定位在細胞質(zhì)中。 4．LIN28和OCT4在人類原始生殖細胞中存在共定位 當PGCs在一個時段同時表達兩個蛋白，即熒光下紅色（LIN28）與綠色(OCT4)雙染色時，我們認為這兩個因子在這個時期的特定細胞中共表達。在亞細胞水平（胞核或胞質(zhì)），如果共表達的兩個對象在胞內(nèi)分布有重疊，我們稱為共定位，那么至少為兩者可能存在的相互作用提供了一個必要條件。最初，大約60%陽性細胞在細胞核中共同表達兩個蛋白LIN28和OCT4。然后，這個比例逐漸增高，在胎齡11周的組織中，共表達比例達到100%。由于LIN28表達表型的變化以及OCT4核定位的穩(wěn)定性，在7-10周的部分細胞中兩個因子共定位于胞核。 結(jié)論 1. LIN28在胎兒睪丸發(fā)育7-20w的原始生殖細胞中高度特異表達，隨胎齡增加表達量逐漸升高。證實其作為一個生殖細胞標記因子的可行性和穩(wěn)定性。 2. LIN28在早期原始生殖細胞中的表達模式經(jīng)歷了由核到質(zhì)的特殊亞細胞定位變化。 3.研究發(fā)現(xiàn)LIN28與全能性基因OCT4的共定位提示兩者可能具有更深的相互作用關(guān)系，來共同調(diào)控原始生殖細胞的形成及發(fā)育。 創(chuàng)新點 本實驗首次系統(tǒng)性地描述了RNA結(jié)合蛋白LIN28在胎兒早期發(fā)育時期的睪丸中原始生殖細胞的表達模式和亞細胞定位變化。
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【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R711.6

【參考文獻】

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1 郭婧;董e

本文編號：2450929