【摘要】：精子的超低溫冷凍保存技術(shù)是輔助生殖技術(shù)以及精子庫(kù)的重要組成部分,此技術(shù)水平的提高以及復(fù)蘇率的穩(wěn)定性都直接影響著最終受孕率。然而精子經(jīng)冷凍復(fù)蘇后,其存活率、活力、DNA完整性、質(zhì)膜蛋白組成以及線粒體基質(zhì)密度等都發(fā)生了不同程度的損傷,并且其宮頸黏液穿透力、穿卵能力等生育力也顯著降低。精子糖萼,又稱糖被,是睪丸生成的精子在附睪成熟過(guò)程中,附睪上皮細(xì)胞產(chǎn)生的各種糖基化修飾的蛋白或脂質(zhì)結(jié)合到精子膜表面而形成的,是雄性配子與外界環(huán)境相互作用的主要界面,在精子保存、精子穿透宮頸黏液以及精子與卵子的識(shí)別和結(jié)合過(guò)程中具有重要作用。精子糖萼損傷可能導(dǎo)致生育力降低甚至不育。然而由于精子糖萼結(jié)構(gòu)復(fù)雜,以往的研究缺乏高通量、簡(jiǎn)便的分析手段,關(guān)于人精子經(jīng)超低溫冷凍后其表面糖萼的變化情況目前尚未報(bào)道。本文通過(guò)比較三種精子冷凍液,自配的以及商業(yè)化的Quinn和ORIGIO,對(duì)精子冷凍復(fù)蘇率的影響,發(fā)現(xiàn)ORIGK)精子冷凍保護(hù)液的復(fù)蘇效果最好;在此基礎(chǔ)上,我們又進(jìn)一步比較了人工降溫法、程序降溫法,以及一步熏蒸法三種冷凍方法對(duì)精子復(fù)蘇率的影響,發(fā)現(xiàn)一步熏蒸法效果最佳。通過(guò)比較優(yōu)化,我們選擇了 ORIGIO精子冷凍保護(hù)液,以及一步熏蒸法進(jìn)行后續(xù)研究超低溫冷凍對(duì)精子糖萼的影響。本課題利用本實(shí)驗(yàn)室已建立的凝集素芯片檢測(cè)人精子糖萼的技術(shù),通過(guò)比較超低溫冷凍前后人精子與凝集素結(jié)合譜,發(fā)現(xiàn)35種凝集素在精子冷凍復(fù)蘇后具有顯著性差異,其中與9種凝集素的結(jié)合顯著增加,26種顯著降低。我們選擇了其中4種與精子結(jié)合增加的凝集素(ABA、AIA、UEAI和PSA)和2種與精子結(jié)合降低的凝集素(MAA和DSL),通過(guò)流式細(xì)胞儀驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)與精子結(jié)合增加的ABA、AIA和PSA以及與精子結(jié)合降低的MAA與芯片結(jié)果一致。這些凝集素未來(lái)可用于評(píng)價(jià)精子冷凍保護(hù)液或精子冷凍方法的優(yōu)劣,為人類精子庫(kù)或輔助生殖中心精子的冷凍條件的優(yōu)化提供新的評(píng)價(jià)方法。另一方面,我們還通過(guò)比較耐凍組和不耐凍組精子與凝集素結(jié)合的差異,發(fā)現(xiàn)耐凍組精子樣本與ABA的結(jié)合顯著降低;通過(guò)大樣本驗(yàn)證,與芯片結(jié)果完全一致,未來(lái)ABA可作為評(píng)價(jià)精子耐凍性能的潛在生物學(xué)標(biāo)志物,為臨床夫精冷凍及冷凍后精子質(zhì)量評(píng)價(jià)提供新的評(píng)價(jià)指標(biāo)。
[Abstract]:Cryopreservation of spermatozoa is an important part of assisted reproduction technology and sperm bank. The improvement of sperm cryopreservation level and the stability of recovery rate directly affect the final pregnancy rate. However, after cryopreservation, the survival rate, viability, DNA integrity, plasma membrane protein composition and mitochondrial matrix density were damaged in varying degrees, and the ability of cervical mucus penetration and the ability to penetrate eggs were also significantly decreased. Sperm glycosylated calyx, also known as sugar quilt, is formed by the binding of various glycosylated proteins or lipids produced by epididymal epithelial cells to the surface of sperm membranes during the maturation of testicular spermatozoa. It is the main interface between male gametes and external environment. It plays an important role in sperm preservation, sperm penetration through cervical mucus, and the recognition and binding of sperm and eggs. Damage to sperm sugar calyx may result in decreased fertility and even infertility. However, due to the complexity of the structure of sperm sugar calyx, the previous studies lack of high-throughput, simple analytical means, the changes of human sperm surface sugar calyx after cryopreservation have not been reported. By comparing the effects of three kinds of cryopreservation solution, self-made and commercial Quinn and ORIGIO, on the recovery rate of spermatozoa, it was found that the recovery effect of cryopreservation solution of ORIGK was the best. On this basis, we further compared the effects of artificial cooling method, programmed cooling method and one-step fumigation method on sperm recovery rate, and found that one-step fumigation method was the best one-step fumigation method. Through comparison and optimization, we chose ORIGIO cryopreservation solution and one-step fumigation to study the effect of cryopreservation on sperm sugar calyx. By comparing the binding spectrum of human sperm and agglutinin before and after cryopreservation, it was found that 35 lectins had significant difference after sperm cryopreservation, and the agglutinin microarray was used to detect the calyx of human spermatozoa by using the lectin microarray established in our laboratory. Among them, the binding to 9 lectins increased significantly, while 26 species decreased significantly. Four of these lectins (ABA,AIA,UEAI and PSA) with increased sperm binding and two lectins (MAA and DSL),) with decreased sperm binding were identified by flow cytometry, and ABA, with increased sperm binding was found. The results of AIA, PSA and MAA with decreased sperm binding were consistent with the results of microarray. These lectins can be used to evaluate the advantages and disadvantages of sperm cryopreservation solution or sperm freezing methods in the future, and provide a new evaluation method for the optimization of freezing conditions of sperm in human sperm bank or assisted reproduction center. On the other hand, we also compared the difference of sperm binding to lectin between freezing-resistant group and non-freezing-tolerant group, and found that the binding of sperm samples to ABA in freezing-resistant group was significantly lower than that in freezing-resistant group. The results of large samples confirmed that ABA could be used as a potential biomarker to evaluate the freezing resistance of spermatozoa and provide a new evaluation index for the quality evaluation of frozen and frozen spermatozoa.
【學(xué)位授予單位】：華東理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R714.8

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本文編號(hào)：2450078