【摘要】：目前體外受精—胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer, IVF-ET)周期成熟卵母細胞的獲得主要有兩種方式：體內成熟和體外成熟。卵母細胞體外成熟(in vitro maturation，，IVM)是指通過體外培養(yǎng),使卵泡內的未成熟卵母細胞發(fā)育成為成熟的第二次減數(shù)分裂中期(metaphasell, MⅡ)卵母細胞。IVM是一項新的輔助生殖技術(Assisted Reproductive Technology,ART),在ART中發(fā)揮極其重要的作用。與傳統(tǒng)經典的IVF相比,IVM技術具有的優(yōu)點是減少大量促排卵藥誘發(fā)的卵巢過度刺激綜合征(OHSS)；縮短治療周期；降低使用外源性促性腺激素的費用；與IVF聯(lián)合應用,可以增加可移植胚胎和冷凍胚胎的數(shù)量,增加累積妊娠率,提高患者助孕成功率。在動物研究方面,IVM成功率相當高,被廣泛應用,是人工養(yǎng)殖、胚胎干細胞技術、克隆和轉基因動物的重要技術平臺。然而,人類IVM仍存在諸多問題：卵母細胞的體外成熟率不高、成熟后卵母細胞的體外受精率和卵裂率較低、胚胎移植后妊娠率較低。自從1991年Cha等報道首例IVM妊娠以來,IVM一直進展緩慢。IVM低成熟率、受精率、妊娠率的關鍵因素是卵母細胞質量差,胚胎發(fā)育不良。卵母細胞質量是女性生殖的關鍵因素,成熟卵母細胞的生化和分子狀態(tài)允許卵母細胞受精和發(fā)育成胚胎,移植后能健康發(fā)育到足月。差的卵母細胞質量導致多精受精或胚胎發(fā)育停滯或自然流產。目前研究發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)卵母細胞核成熟幾乎不受影響,其胞質成熟不完全可能是其發(fā)育能力下降的重要原因。 卵泡發(fā)育過程中,卵母細胞與卵丘細胞通過縫隙連接和旁分泌方式形成一個很重要的雙向調節(jié)軸,卵母細胞起主導作用,在卵母細胞生長發(fā)育中所釋放的分泌因子、生長因子等調控卵丘細胞的分化和功能,反過來卵丘細胞又控制卵母細胞生長環(huán)境,影響卵母細胞的發(fā)育。卵母細胞與卵丘細胞的這種相互作用使得兩者共同發(fā)育生長,最終促進了卵母細胞的成熟。卵丘細胞在卵母細胞成熟特別是胞質成熟過程中起重要作用,體外培養(yǎng)中,卵母細胞與卵丘細胞之間信息傳遞減弱以及細胞生長環(huán)境改變引起的應激反應,可能導致卵丘細胞功能改變,進而影響卵母細胞發(fā)育。所以,對卵丘細胞功能的研究可能是探討卵母細胞體外成熟的一條新思路。目前對于IVM卵丘細胞的研究主要集中于-些特定蛋白,未能從整體上系統(tǒng)地分析卵丘細胞的蛋白質群及其作用。因此,本實驗通過研究體外與體內成熟卵丘-卵母細胞復合體(cumulus-oocyte complexes, COCs)中卵丘細胞的蛋白質表達的差異,尋找與體外卵母細胞成熟相關的重要蛋白質群,利用卵丘細胞蛋白質組學的研究確定人卵丘細胞不同分子與卵母細胞發(fā)育能力的相關性,為預測卵母細胞發(fā)育能力確定新的可靠標志物。 第一部分體內外成熟卵丘-卵母細胞復合體(COCs)中卵丘細胞蛋白質組的差異表達分析 目的： 比較體外培養(yǎng)成熟與體內成熟COCs中卵丘細胞的蛋白質表達的差異,尋找與卵母細胞體外成熟相關的重要蛋白質群。 方法： 1、研究對象選擇2012年4-10月在深圳市婦幼保健院生殖中心單純因男性因素行卵胞漿內單精子注射-胚胎移植(ICSI-ET)治療的患者20例。 2、標本收集及分組20例患者進行常規(guī)長方案降調和超排卵,3個以上卵泡平均直徑達到16mm,注射HCG,34-36小時內取卵。取卵后,在體視顯微鏡下將卵冠丘復合體分級：卵冠丘復合體大而松散,放射冠界限清楚者為成熟COCs:卵冠丘復合體小而致密,放射冠緊包繞在透明帶周圍者為不成熟COCs。(1)體內成熟卵丘細胞的收集：將成熟的COCs孵育4h,ICSI之前,用巴士德吸管吹散COCs周圍的卵丘細胞,拆除卵丘細胞后的卵母細胞在倒置顯微鏡下觀察其成熟度,收集成熟卵母細胞周圍的卵丘細胞,標為對照組。(2)體外成熟卵丘細胞的收集：將不成熟COCs置于添加了0.075IU/ml HMG的成熟培養(yǎng)液中,于37-C,5%C02,95%濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24-36h后用注射針剝除卵丘細胞,觀察卵母細胞是否排出第一極體,收集排出第一極體卵母細胞周圍的卵丘細胞,標為實驗組。 3、實驗方法將收集到的兩組卵丘細胞進行雙向凝膠電泳,用ImageMaster2D platinum5.0軟件對凝膠圖像進行分析找出差異蛋白質點,并用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀(MALDI-TOF-MS)進行肽指紋圖譜鑒定,通過Mascot軟件進行數(shù)據(jù)庫搜索,鑒定出具體的差異蛋白質。 結果： 1、在20例患者中,共獲取116個未成熟卵,平均每患者獲得5.8個,經24-36小時體外培養(yǎng)后,成熟85個,體外成熟率為73.28%(85/116)。 2、雙向凝膠電泳結果 雙向凝膠電泳所得到的圖譜,經ImageMaster2D platinum5.0軟件分析后,共找到23個差異蛋白質點。實驗組與對照組相比,共有13個蛋白質表達上調(其中7個蛋白質的表達水平在實驗組是對照組的3倍以上；6個蛋白質在實驗組有表達,而在對照組中無表達),10個蛋白質表達下調(其中2個蛋白質的表達水平,實驗組比對照組降低3倍以上；8個蛋白質在實驗組無表達,在對照組中有表達)。 3、差異蛋白質質譜鑒定結果 根據(jù)蛋白質的分子量、等電點及差異倍數(shù)≥3倍等綜合條件,選擇10個差異蛋白點進行MALDI-TOF-MS分析,通過Mascot查詢軟件及搜索NCBInr數(shù)據(jù)庫,結果PRO2044蛋白(ALB)、KIAA1191蛋白(KIAA1191)、乙酰輔酶A�；D移酶2蛋白(ACAA2)、Ⅱ型角蛋白(KRT2)和ARID2蛋白(ARID2)共五種蛋白質被確定為差異表達蛋白質。 結論： 1、來自于超排卵周期中的未成熟卵母細胞具有在體外成熟的能力。 2、通過蛋白質組學研究技術發(fā)現(xiàn)卵丘-卵母細胞復合體在體內成熟與體外成熟存在蛋白質表達差異,這些差異表達蛋白質與清除自由基、抗凋亡、細胞周期調控等生物功能相關,這些蛋白質的表達異�？赡苁求w外成熟卵母細胞質量差的原因之一 第二部分應用實時熒光定量PCR (RT-qPCR)技術分析卵丘細胞差異蛋白表達與卵母細胞及胚胎發(fā)育之間的關系 目的： 觀察篩選出的差異蛋白在體內成熟卵丘細胞中的表達與卵母細胞及其后續(xù)胚胎發(fā)育能力的關系,探討新的預測卵母細胞發(fā)育能力的標志物。 方法： 1、研究對象選擇2012年11月～2013年4月在深圳市婦幼保健院生殖中心單純因男性因素行ICSI-ET治療的患者20例。 2、標本收集體內成熟卵丘細胞的收集方法同第一部分。 3、實驗方法 3.1實時熒光定量PCR檢測：應用RT-qPCR技術檢測第一部分研究鑒定出的五種差異蛋白(ALB、KIAA1191、ACAA2、KRT2和ARID2) mRNA在收集到的每例患者卵丘細胞的表達水平。采用Trizol法提取每例患者卵丘細胞的總RNA,并測量其RNA濃度及純度,A260/A280比值在1.8～2.0范圍。將mRNA逆轉錄成cDNA,用ABI7300型實時熒光定量PCR儀進行PCR擴增,計算出五種蛋白nRNA的表達水平。 3.2卵母細胞及后續(xù)胚胎發(fā)育能力的觀察：卵母細胞及后續(xù)胚胎發(fā)育能力用受精率、卵裂率、優(yōu)質胚胎形成率和胚胎種植率評價。 4、統(tǒng)計學分析采用SPSS13.0軟件統(tǒng)計學分析,mRNA表達水平用均數(shù)±標準差(x±s)表示。計量資料采用檢驗；正態(tài)分布的雙變量資料,采用Pearon相關分析,非正態(tài)分布,用Spearman相關分析。P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。 結果： 1、RT-qPCR相對定量結果 卵丘細胞上五種蛋白nRNA均有表達。所有的溶解曲線峰均為特異的單峰,熔點溫度(波峰對應的溫度)均在82℃以上,表明五種目的基因和內參基因p-actin的擴增產物均有特異性。ALBmRNA、KIAA1191mRNA、ACAA2mRNA、 KRT2mRNA和ARID2mRNA的相對表達量分別為1.8474±1.1825、1.2122±0.8379、1.3388±1.6907、1.0810±0.6026、1.4712±0.8401。 2、五種蛋白nRNA表達量與受精率、卵裂率、優(yōu)胚率及種植率的相關性 ACAA2mRNA和ARID2mRNA相對表達量與優(yōu)胚率呈正相關(r=0.471,P=0.036;r=0.849,P=0.000),與受精率、卵裂率和種植率無明顯相關性((r=0.081,P=0.736; r=-0.075, P=0.754; r=0.283, P=0.240; r=0.194, P=0.413; r=0.184, P=0.436; r=0.201, P=0.394); ALBmRNA、KIAA1191mRNA和KRT2mRNA相對表達量與受精率、卵裂率、優(yōu)胚率和種植率均無明顯相關性；五種蛋白mRNA表達量與獲卵數(shù)、患者不孕年限、使用促性腺激素天數(shù)和總劑量、基礎性激素水平等均無相關性。 3、妊娠組與未妊娠組五種蛋白mRNA相對表達量的比較 妊娠組與未妊娠組比較,卵丘細胞五種蛋白mRNA的相對表達量無顯著性差異(P=0.091、0.399、0.411、0.266和0.293)。 4、卵丘細胞五種蛋白nRNA之間表達量的相關性 ARID2mRNA與ACAA2mRNA表達量呈顯著正相關(r=0.504,P=0.024),其余表達量之間無明顯相關性。 結論： 1、五種差異蛋白質mRNA,即ALB、KIAA1191、ACAA2、KRT2和ARID2mRNA在體內成熟卵丘細胞上均有表達,其中ARID2mRNA與ACAA2mRNA表達量呈顯著正相關。 2、ACAA2mRNA和ARID2mRNA相對表達量與優(yōu)質胚胎率呈顯著正相關。 3、ACAA2mRNA及ARID2mRNA在體內成熟卵丘細胞上表達,而其蛋白在體外成熟卵丘細胞未表達,可能是體外成熟卵母細胞發(fā)育能力差的重要因素。 4、卵丘細ACAA2mRNA和ARID2mRNA定量檢測可以作為一種無創(chuàng)、定量的方法預測胚胎發(fā)育潛能,是胚胎質量的預測標志物。
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【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R714.8

【參考文獻】

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本文編號：2442718