【摘要】：目前體外受精—胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer, IVF-ET)周期成熟卵母細(xì)胞的獲得主要有兩種方式：體內(nèi)成熟和體外成熟。卵母細(xì)胞體外成熟(in vitro maturation，，IVM)是指通過(guò)體外培養(yǎng),使卵泡內(nèi)的未成熟卵母細(xì)胞發(fā)育成為成熟的第二次減數(shù)分裂中期(metaphasell, MⅡ)卵母細(xì)胞。IVM是一項(xiàng)新的輔助生殖技術(shù)(Assisted Reproductive Technology,ART),在ART中發(fā)揮極其重要的作用。與傳統(tǒng)經(jīng)典的IVF相比,IVM技術(shù)具有的優(yōu)點(diǎn)是減少大量促排卵藥誘發(fā)的卵巢過(guò)度刺激綜合征(OHSS)；縮短治療周期；降低使用外源性促性腺激素的費(fèi)用；與IVF聯(lián)合應(yīng)用,可以增加可移植胚胎和冷凍胚胎的數(shù)量,增加累積妊娠率,提高患者助孕成功率。在動(dòng)物研究方面,IVM成功率相當(dāng)高,被廣泛應(yīng)用,是人工養(yǎng)殖、胚胎干細(xì)胞技術(shù)、克隆和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的重要技術(shù)平臺(tái)。然而,人類IVM仍存在諸多問(wèn)題：卵母細(xì)胞的體外成熟率不高、成熟后卵母細(xì)胞的體外受精率和卵裂率較低、胚胎移植后妊娠率較低。自從1991年Cha等報(bào)道首例IVM妊娠以來(lái),IVM一直進(jìn)展緩慢。IVM低成熟率、受精率、妊娠率的關(guān)鍵因素是卵母細(xì)胞質(zhì)量差,胚胎發(fā)育不良。卵母細(xì)胞質(zhì)量是女性生殖的關(guān)鍵因素,成熟卵母細(xì)胞的生化和分子狀態(tài)允許卵母細(xì)胞受精和發(fā)育成胚胎,移植后能健康發(fā)育到足月。差的卵母細(xì)胞質(zhì)量導(dǎo)致多精受精或胚胎發(fā)育停滯或自然流產(chǎn)。目前研究發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)卵母細(xì)胞核成熟幾乎不受影響,其胞質(zhì)成熟不完全可能是其發(fā)育能力下降的重要原因。 卵泡發(fā)育過(guò)程中,卵母細(xì)胞與卵丘細(xì)胞通過(guò)縫隙連接和旁分泌方式形成一個(gè)很重要的雙向調(diào)節(jié)軸,卵母細(xì)胞起主導(dǎo)作用,在卵母細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育中所釋放的分泌因子、生長(zhǎng)因子等調(diào)控卵丘細(xì)胞的分化和功能,反過(guò)來(lái)卵丘細(xì)胞又控制卵母細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境,影響卵母細(xì)胞的發(fā)育。卵母細(xì)胞與卵丘細(xì)胞的這種相互作用使得兩者共同發(fā)育生長(zhǎng),最終促進(jìn)了卵母細(xì)胞的成熟。卵丘細(xì)胞在卵母細(xì)胞成熟特別是胞質(zhì)成熟過(guò)程中起重要作用,體外培養(yǎng)中,卵母細(xì)胞與卵丘細(xì)胞之間信息傳遞減弱以及細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境改變引起的應(yīng)激反應(yīng),可能導(dǎo)致卵丘細(xì)胞功能改變,進(jìn)而影響卵母細(xì)胞發(fā)育。所以,對(duì)卵丘細(xì)胞功能的研究可能是探討卵母細(xì)胞體外成熟的一條新思路。目前對(duì)于IVM卵丘細(xì)胞的研究主要集中于-些特定蛋白,未能從整體上系統(tǒng)地分析卵丘細(xì)胞的蛋白質(zhì)群及其作用。因此,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究體外與體內(nèi)成熟卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(cumulus-oocyte complexes, COCs)中卵丘細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)的差異,尋找與體外卵母細(xì)胞成熟相關(guān)的重要蛋白質(zhì)群,利用卵丘細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)的研究確定人卵丘細(xì)胞不同分子與卵母細(xì)胞發(fā)育能力的相關(guān)性,為預(yù)測(cè)卵母細(xì)胞發(fā)育能力確定新的可靠標(biāo)志物。 第一部分體內(nèi)外成熟卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)中卵丘細(xì)胞蛋白質(zhì)組的差異表達(dá)分析 目的： 比較體外培養(yǎng)成熟與體內(nèi)成熟COCs中卵丘細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)的差異,尋找與卵母細(xì)胞體外成熟相關(guān)的重要蛋白質(zhì)群。 方法： 1、研究對(duì)象選擇2012年4-10月在深圳市婦幼保健院生殖中心單純因男性因素行卵胞漿內(nèi)單精子注射-胚胎移植(ICSI-ET)治療的患者20例。 2、標(biāo)本收集及分組20例患者進(jìn)行常規(guī)長(zhǎng)方案降調(diào)和超排卵,3個(gè)以上卵泡平均直徑達(dá)到16mm,注射HCG,34-36小時(shí)內(nèi)取卵。取卵后,在體視顯微鏡下將卵冠丘復(fù)合體分級(jí)：卵冠丘復(fù)合體大而松散,放射冠界限清楚者為成熟COCs:卵冠丘復(fù)合體小而致密,放射冠緊包繞在透明帶周?chē)邽椴怀墒霤OCs。(1)體內(nèi)成熟卵丘細(xì)胞的收集：將成熟的COCs孵育4h,ICSI之前,用巴士德吸管吹散COCs周?chē)穆亚鸺?xì)胞,拆除卵丘細(xì)胞后的卵母細(xì)胞在倒置顯微鏡下觀察其成熟度,收集成熟卵母細(xì)胞周?chē)穆亚鸺?xì)胞,標(biāo)為對(duì)照組。(2)體外成熟卵丘細(xì)胞的收集：將不成熟COCs置于添加了0.075IU/ml HMG的成熟培養(yǎng)液中,于37-C,5%C02,95%濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24-36h后用注射針剝除卵丘細(xì)胞,觀察卵母細(xì)胞是否排出第一極體,收集排出第一極體卵母細(xì)胞周?chē)穆亚鸺?xì)胞,標(biāo)為實(shí)驗(yàn)組。 3、實(shí)驗(yàn)方法將收集到的兩組卵丘細(xì)胞進(jìn)行雙向凝膠電泳,用ImageMaster2D platinum5.0軟件對(duì)凝膠圖像進(jìn)行分析找出差異蛋白質(zhì)點(diǎn),并用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF-MS)進(jìn)行肽指紋圖譜鑒定,通過(guò)Mascot軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)搜索,鑒定出具體的差異蛋白質(zhì)。 結(jié)果： 1、在20例患者中,共獲取116個(gè)未成熟卵,平均每患者獲得5.8個(gè),經(jīng)24-36小時(shí)體外培養(yǎng)后,成熟85個(gè),體外成熟率為73.28%(85/116)。 2、雙向凝膠電泳結(jié)果 雙向凝膠電泳所得到的圖譜,經(jīng)ImageMaster2D platinum5.0軟件分析后,共找到23個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比,共有13個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)(其中7個(gè)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平在實(shí)驗(yàn)組是對(duì)照組的3倍以上；6個(gè)蛋白質(zhì)在實(shí)驗(yàn)組有表達(dá),而在對(duì)照組中無(wú)表達(dá)),10個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)(其中2個(gè)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平,實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組降低3倍以上；8個(gè)蛋白質(zhì)在實(shí)驗(yàn)組無(wú)表達(dá),在對(duì)照組中有表達(dá))。 3、差異蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定結(jié)果 根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)及差異倍數(shù)≥3倍等綜合條件,選擇10個(gè)差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析,通過(guò)Mascot查詢軟件及搜索NCBInr數(shù)據(jù)庫(kù),結(jié)果PRO2044蛋白(ALB)、KIAA1191蛋白(KIAA1191)、乙酰輔酶A�；D(zhuǎn)移酶2蛋白(ACAA2)、Ⅱ型角蛋白(KRT2)和ARID2蛋白(ARID2)共五種蛋白質(zhì)被確定為差異表達(dá)蛋白質(zhì)。 結(jié)論： 1、來(lái)自于超排卵周期中的未成熟卵母細(xì)胞具有在體外成熟的能力。 2、通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)發(fā)現(xiàn)卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體在體內(nèi)成熟與體外成熟存在蛋白質(zhì)表達(dá)差異,這些差異表達(dá)蛋白質(zhì)與清除自由基、抗凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控等生物功能相關(guān),這些蛋白質(zhì)的表達(dá)異�？赡苁求w外成熟卵母細(xì)胞質(zhì)量差的原因之一 第二部分應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (RT-qPCR)技術(shù)分析卵丘細(xì)胞差異蛋白表達(dá)與卵母細(xì)胞及胚胎發(fā)育之間的關(guān)系 目的： 觀察篩選出的差異蛋白在體內(nèi)成熟卵丘細(xì)胞中的表達(dá)與卵母細(xì)胞及其后續(xù)胚胎發(fā)育能力的關(guān)系,探討新的預(yù)測(cè)卵母細(xì)胞發(fā)育能力的標(biāo)志物。 方法： 1、研究對(duì)象選擇2012年11月～2013年4月在深圳市婦幼保健院生殖中心單純因男性因素行ICSI-ET治療的患者20例。 2、標(biāo)本收集體內(nèi)成熟卵丘細(xì)胞的收集方法同第一部分。 3、實(shí)驗(yàn)方法 3.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)：應(yīng)用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)第一部分研究鑒定出的五種差異蛋白(ALB、KIAA1191、ACAA2、KRT2和ARID2) mRNA在收集到的每例患者卵丘細(xì)胞的表達(dá)水平。采用Trizol法提取每例患者卵丘細(xì)胞的總RNA,并測(cè)量其RNA濃度及純度,A260/A280比值在1.8～2.0范圍。將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,用ABI7300型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增,計(jì)算出五種蛋白nRNA的表達(dá)水平。 3.2卵母細(xì)胞及后續(xù)胚胎發(fā)育能力的觀察：卵母細(xì)胞及后續(xù)胚胎發(fā)育能力用受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎形成率和胚胎種植率評(píng)價(jià)。 4、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS13.0軟件統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,mRNA表達(dá)水平用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。計(jì)量資料采用檢驗(yàn)；正態(tài)分布的雙變量資料,采用Pearon相關(guān)分析,非正態(tài)分布,用Spearman相關(guān)分析。P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1、RT-qPCR相對(duì)定量結(jié)果 卵丘細(xì)胞上五種蛋白nRNA均有表達(dá)。所有的溶解曲線峰均為特異的單峰,熔點(diǎn)溫度(波峰對(duì)應(yīng)的溫度)均在82℃以上,表明五種目的基因和內(nèi)參基因p-actin的擴(kuò)增產(chǎn)物均有特異性。ALBmRNA、KIAA1191mRNA、ACAA2mRNA、 KRT2mRNA和ARID2mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為1.8474±1.1825、1.2122±0.8379、1.3388±1.6907、1.0810±0.6026、1.4712±0.8401。 2、五種蛋白nRNA表達(dá)量與受精率、卵裂率、優(yōu)胚率及種植率的相關(guān)性 ACAA2mRNA和ARID2mRNA相對(duì)表達(dá)量與優(yōu)胚率呈正相關(guān)(r=0.471,P=0.036;r=0.849,P=0.000),與受精率、卵裂率和種植率無(wú)明顯相關(guān)性((r=0.081,P=0.736; r=-0.075, P=0.754; r=0.283, P=0.240; r=0.194, P=0.413; r=0.184, P=0.436; r=0.201, P=0.394); ALBmRNA、KIAA1191mRNA和KRT2mRNA相對(duì)表達(dá)量與受精率、卵裂率、優(yōu)胚率和種植率均無(wú)明顯相關(guān)性；五種蛋白mRNA表達(dá)量與獲卵數(shù)、患者不孕年限、使用促性腺激素天數(shù)和總劑量、基礎(chǔ)性激素水平等均無(wú)相關(guān)性。 3、妊娠組與未妊娠組五種蛋白mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較 妊娠組與未妊娠組比較,卵丘細(xì)胞五種蛋白mRNA的相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著性差異(P=0.091、0.399、0.411、0.266和0.293)。 4、卵丘細(xì)胞五種蛋白nRNA之間表達(dá)量的相關(guān)性 ARID2mRNA與ACAA2mRNA表達(dá)量呈顯著正相關(guān)(r=0.504,P=0.024),其余表達(dá)量之間無(wú)明顯相關(guān)性。 結(jié)論： 1、五種差異蛋白質(zhì)mRNA,即ALB、KIAA1191、ACAA2、KRT2和ARID2mRNA在體內(nèi)成熟卵丘細(xì)胞上均有表達(dá),其中ARID2mRNA與ACAA2mRNA表達(dá)量呈顯著正相關(guān)。 2、ACAA2mRNA和ARID2mRNA相對(duì)表達(dá)量與優(yōu)質(zhì)胚胎率呈顯著正相關(guān)。 3、ACAA2mRNA及ARID2mRNA在體內(nèi)成熟卵丘細(xì)胞上表達(dá),而其蛋白在體外成熟卵丘細(xì)胞未表達(dá),可能是體外成熟卵母細(xì)胞發(fā)育能力差的重要因素。 4、卵丘細(xì)ACAA2mRNA和ARID2mRNA定量檢測(cè)可以作為一種無(wú)創(chuàng)、定量的方法預(yù)測(cè)胚胎發(fā)育潛能,是胚胎質(zhì)量的預(yù)測(cè)標(biāo)志物。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R714.8

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2442718