【摘要】：研究背景 卵巢癌是婦科最常見的惡性腫瘤之一,病死率居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之首,約占所有婦科惡性腫瘤的15%。據(jù)統(tǒng)計(jì),在美國每年發(fā)病人數(shù)為2.5萬,死亡達(dá)到1.6萬,世界范圍內(nèi)每年死亡人數(shù)高達(dá)11.4萬,嚴(yán)重危害了婦女的身體健康。由于卵巢癌具有起病隱匿、早期不易發(fā)現(xiàn)、易轉(zhuǎn)移、預(yù)后差等特點(diǎn)以及缺乏早期診斷方法和有效的治療方法,70%-80%的卵巢癌患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)發(fā)展到晚期,5年存活率僅為20%-30%,而早期卵巢癌患者的存活率可達(dá)90%。 眾所周知,相同的癌癥在不同個(gè)體上的發(fā)病表現(xiàn)不同,相同的發(fā)病表現(xiàn)卻需要不同的診斷和治療方案；癌癥的不同分期雖然反映了癌癥的一些特性,同時(shí)也能幫助臨床醫(yī)生制定針對特定分期的治療方案,但是由于分子水平的變化導(dǎo)致的個(gè)性差異性使得相同的病理分期用相同的治療方案卻得到了不同的治療結(jié)果。這一現(xiàn)象的根本原因就是目前無論是科學(xué)家還是臨床醫(yī)生對特定癌癥在人體內(nèi)部發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制了解的不多,不能達(dá)到個(gè)體化治療的階段。應(yīng)對這一問題的方法就是在大量臨床樣本的支持下,在癌癥的某一分子水平上利用生物信息學(xué)的方法進(jìn)行系統(tǒng)研究。 染色體變異在腫瘤發(fā)生中被大量觀察到,它包括結(jié)構(gòu)變異和拷貝數(shù)變異�？截悢�(shù)變異在諸如在乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肺癌、和頭頸癌等多種腫瘤細(xì)胞中都很常見。多個(gè)研究表明,基因拷貝數(shù)變異在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中扮演著一個(gè)重要角色。在不同的腫瘤中,拷貝數(shù)變異的數(shù)量、大小和幅度都是非常不同的,并且可能反映腫瘤逃離正常保護(hù)細(xì)胞環(huán)境下的個(gè)體差異。探討拷貝數(shù)變異有助于發(fā)現(xiàn)它們在卵巢癌中扮演的角色。使用高通量陣列比較基因組雜交芯片能夠掃描卵巢癌基因組,識別多個(gè)畸變區(qū)域,深入研究位于這些拷貝數(shù)變異區(qū)域的基因可以發(fā)現(xiàn)它們在卵巢癌發(fā)生機(jī)制中的作用。 腫瘤細(xì)胞的基因擴(kuò)增是增加原癌細(xì)胞基因表達(dá)的一個(gè)重要的機(jī)制,而由于拷貝數(shù)缺失而下調(diào)的基因可能轉(zhuǎn)換成關(guān)鍵的腫瘤抑制基因。 為了更好地闡述卵巢癌的病因?qū)W和識別預(yù)后基因集,很多研究已經(jīng)完成了基于微陣列的基因表達(dá)譜分析,同時(shí)在各自的數(shù)據(jù)集中識別了確實(shí)和卵巢癌生存率顯著相關(guān)的基因集。但是在不同研究產(chǎn)生的基因集中只有少數(shù)的基因是相同的。這種不相符可能是由于基因表達(dá)分析是來自多個(gè)實(shí)驗(yàn)協(xié)議,不同的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法或者不同類的特征排列方法。解決這一問題的一種可能的策略是分析同時(shí)發(fā)生基因表達(dá)和DNA水平變化(例如拷貝數(shù)變異)的基因。 不同類型的基因拷貝數(shù)變異在基因表達(dá)上的影響是不同的。最近的研究表明,腫瘤中40%-50%的高度擴(kuò)增基因同時(shí)也是表達(dá)上調(diào)基因；而缺失對表達(dá)下調(diào)的影響就不是很明顯,主要是由于檢測小的缺失所導(dǎo)致的表達(dá)下調(diào)對技術(shù)的挑戰(zhàn)更大�？傊�,已經(jīng)證明有10%-15%的基因表達(dá)變化是和拷貝數(shù)變化直接相關(guān)的。識別擴(kuò)增和基因表達(dá)上調(diào)或者缺失和基因表達(dá)下調(diào)的關(guān)系也許可以發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致腫瘤發(fā)病的關(guān)鍵變異。 目的 本課題的研究目的在于利用TCGA拷貝數(shù)數(shù)據(jù)找出卵巢癌中存在的拷貝數(shù)變異區(qū)域及基因,并選取其中顯著擴(kuò)增的基因在基因表達(dá)數(shù)據(jù)中尋找存在差異表達(dá)的基因。研究同時(shí)有拷貝數(shù)擴(kuò)增和表達(dá)上調(diào)的基因?qū)τ锌截悢?shù)變異和沒有拷貝數(shù)變異樣本之間基因表達(dá)的影響,并且驗(yàn)證差異表達(dá)是否與拷貝數(shù)變異相關(guān)。 方法 為了研究卵巢癌的拷貝數(shù)變異,我們對從TCGA數(shù)據(jù)庫上下載獲得97例卵巢癌樣本利用環(huán)形二元分割法(Circular Binary Segmentation, CBS)分割來獲得每個(gè)樣本中存在的拷貝數(shù)變異。然后為了從每個(gè)樣本中識別出卵巢癌中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的拷貝數(shù)變異,我們利用GISTIC方法對由CBS分割獲得97例樣本的拷貝數(shù)變異片段進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。通過GISTIC分析,我們可以獲得卵巢癌中顯著的拷貝數(shù)變異區(qū)域以及區(qū)域中包含的基因。 從GISTIC分析獲得的拷貝數(shù)變異區(qū)域中篩選出拷貝數(shù)擴(kuò)增的基因,并在97例卵巢癌和8例卵巢組織樣本的基因表達(dá)芯片數(shù)據(jù)中篩選出其表達(dá)值。利用微陣列顯著性分析(Significance Analysis of Microarray, SAM)方法對拷貝數(shù)擴(kuò)增基因在兩類樣本間進(jìn)行差異表達(dá)分析,并從所有的差異表達(dá)基因中篩選出表達(dá)上調(diào)基因,從而獲得同時(shí)存在拷貝數(shù)擴(kuò)增和表達(dá)上調(diào)的基因。 從GISTIC分析結(jié)果中篩選出同時(shí)存在拷貝數(shù)擴(kuò)增和表達(dá)上調(diào)的基因在97例腫瘤樣本中的拷貝數(shù)水平,并將它們分成有拷貝數(shù)擴(kuò)增和沒有拷貝數(shù)擴(kuò)增兩類,其中拷貝數(shù)缺失和沒有拷貝數(shù)變異都認(rèn)為是沒有拷貝數(shù)擴(kuò)增。利用SAM方法識別兩類樣本之間存在的差異表達(dá)基因,對差異表達(dá)基因和同時(shí)存在拷貝數(shù)擴(kuò)增和表達(dá)上調(diào)的基因做Fisher精確檢驗(yàn),獲得分子標(biāo)簽基因。在探討分子標(biāo)簽基因過程中使用了基因富集分析的網(wǎng)絡(luò)軟件GATHER來考察標(biāo)簽基因的GO功能富集和KEGG相關(guān)通路富集。 本研究中的環(huán)形二元分割分析和SAM分析使用R語言(windows系統(tǒng)2.15.3版本)下的Bioconductor生物信息分析軟件中的DNAcopy軟件包和samr軟件包。GISTIC分析使用的是在線平臺GenePattern中的GISTIC模塊來完成的,其它的統(tǒng)計(jì)分析同樣使用R語言完成。R語言是免費(fèi)開源的環(huán)境平臺,適合統(tǒng)計(jì)計(jì)算和圖形化顯示計(jì)算結(jié)果。R語言平臺最大的優(yōu)勢就是多元的軟件包,這些軟件包都是世界上不同領(lǐng)域的科研人員開發(fā)和維護(hù)的。R語言平臺非常適用于高�？蒲胁⑶以谏婕暗缴镄畔⒎治龅念I(lǐng)域具有較高的權(quán)威。 結(jié)果 97例卵巢癌在通過CBS和GISTIC分析后,發(fā)現(xiàn)在21條染色體上的48個(gè)區(qū)域存在顯著的拷貝數(shù)擴(kuò)增,在22條染色體上的54個(gè)區(qū)域存在顯著的拷貝數(shù)缺失。擴(kuò)增區(qū)域中包含174個(gè)候選基因,其中有多個(gè)基因已經(jīng)被證實(shí)為致癌基因,包括EVI、KRAS、CCNE1、MYC;缺失區(qū)域包含2712個(gè)候選基因。 SAM分析發(fā)現(xiàn)174個(gè)擴(kuò)增基因中的55個(gè)基因在卵巢癌中存在差異表達(dá),其中45個(gè)表達(dá)上調(diào),10個(gè)表達(dá)下調(diào)。 對45個(gè)拷貝數(shù)變異方向和基因表達(dá)方向一致的基因發(fā)現(xiàn),其中有40個(gè)基因在有拷貝數(shù)擴(kuò)增和沒有拷貝數(shù)擴(kuò)增樣本之間至少能引起一個(gè)基因產(chǎn)生差異表達(dá),并且它們兩者之間是存在相關(guān)性的。 對40個(gè)標(biāo)簽基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)它們主要集中在細(xì)胞代謝、細(xì)胞合成、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等生物學(xué)過程,并且參與了CCNE1細(xì)胞周期、MAPK信號通路、TGF-beta信號通路和肌動蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)等細(xì)胞通路。同時(shí)它們多數(shù)都與已經(jīng)發(fā)表的腫瘤相關(guān)的研究有重疊。 結(jié)論 在本文中我們通過CBS分割和GISTIC分析,識別了卵巢癌中常見的具有顯著性的拷貝數(shù)變異區(qū)域,同時(shí)獲得了該區(qū)域內(nèi)相關(guān)的基因。利用腫瘤樣本和正常組織樣本,我們檢測到了腫瘤樣本中存在差異表達(dá)的基因。最后,利用統(tǒng)計(jì)分析方法得到拷貝數(shù)變異和表達(dá)存在相關(guān)性的基因,并對它們進(jìn)行生物信息分析來獲取有效的信息,為確定卵巢癌的早期診斷和治療靶點(diǎn)提供新的參考。本文在最后指出了研究結(jié)果的意義以及該研究中存在的不足和有待進(jìn)一步深入研究的問題。作為腫瘤研究的一個(gè)范例,本研究中使用的分析策略同樣適用于其它癌癥的研究,如果能通過將更多水平的數(shù)據(jù)整合進(jìn)行分析,那么得到的綜合分析結(jié)果將更具有參考和指導(dǎo)意義。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R737.31

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